HCMV基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达及病毒感染对细胞自噬的影响

发布时间：2017-12-16 21:22

  本文关键词：HCMV基因在小鼠胚胎成纤维细胞中的表达及病毒感染对细胞自噬的影响

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【摘要】：目的： 1.检测人巨细胞病毒(human cytomegalo virus, HCMV)基因在人胚胎成纤维细胞(Human embryo fibroblast, HEF)和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)中的表达情况,为进一步研究HCMV种属特异性的机制奠定分子生物学基础。 2.观察HCMV感染对HEF和MEF细胞自噬的影响,为HCMV种属特异性的研究寻找新的方向和证据。 方法： 1.组织块分离培养法结合胶原酶消化法分离原代HEF和MEF细胞。 2.在HEF细胞中扩增HCMV AD169毒株,空斑定量法测定病毒滴度。 3.相差显微镜下观察病毒感染(M0I=5)后HEF和MEF细胞的形态学改变。 4. RT-PCR、Western-blot、免疫荧光法检测HCMV-IE、UL84、UL83的表达。 5.MTT比色法检测HEF和MEF细胞的增殖活性。 6.单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)染色法和透射电镜检测胞内自噬体。 7. Western-blot检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3的表达：免疫荧光法检测LC3的表 达。 结果： 1.成功分离培养并纯化原代HEF和MEF细胞,传代后细胞状态良好。 2.用HCMV分别感染HEF和MEF细胞后,HEF细胞第2d逐渐变大变圆并相互融合,第4d超过80%细胞可见典型的HCMV特征性病变效应(CPE),而MEF细胞在相应时间未出现上述的变化。 3. RT-PCR和Western-blot表明HEF细胞表达HCMV-IE1、IE2、UL84和UL83mRNA以及其编码的蛋白,相对表达量显著高于正常对照组(P0.01)；而MEF细胞仅表达IE1和IE2mRNA和蛋白,且相对表达量显著低于HEF细胞(P0.05)。免疫荧光结果发现HCMV感染HEF细胞72h表达IE和UL83蛋白,而MEF细胞则无明显表达。 4.MTT检测显示HCMV感染HEF细胞24h内,细胞增殖活性升高,24h后随着感染时间的延长而降低,而HCMV感染MEF细胞后,96h内细胞增殖活性持续升高(P0.05)。 5.MDC染色后观察显示HEF和MEF细胞感染后24h,多数核周出现的大量蓝绿色的点状结构,24h后HEF细胞阳性细胞数逐渐减少,细胞内蓝绿色点状结构密度减弱,而MEF细胞阳性细胞数和细胞内蓝绿色点状结构密度仍然逐渐增强,明显高于HEF感染组。 6.透射电镜观察发现HCMV惑染后HEF和MEF细胞浆内均出现大量囊泡状结构,高倍镜下可见双层膜结构,其中包含未完全降解或者已降解的细胞器等。 7. Western-blot吉果显示,HCMV感染HEF和MEF细胞后Beclin1和LC3-II/LC3-I的相对表达量升高,显著高于模拟感染组(P0.01)：而HEF细胞在感染24h后逐渐降低,但高于正常对照组(P0.01)；而MEF细胞24hBeclin1和LC3-II/LC3-I的相对表达量逐渐升高,显著高于HEF组(P0.05)。免疫荧光检测LC3蛋白结果与Western-blot结果一致。 结论： 1. HCMV在MEF细胞中的复制停滞在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前的时相,不能产生完整的子代病毒颗粒。推断即刻早期蛋白在MEF细胞内的低水平表达可能与HCMV的种属特异性相关。 2. HCMV感染早期诱导HEF和MEF细胞发生自噬,但感染后期HEF细胞的自噬效应被抑制,而MEF细胞的自噬并不被明显抑制。 3. HCMV感染导致HEF和MEF细胞的不同自噬效应可能与病毒编码蛋白IE之后的蛋白表达相关
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373

【参考文献】

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1 赵杨,陈敦金,闻良珍;人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年10期

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本文编号：1297516