RNAi抑制卡氏肺孢子TS基因表达的实验研究

发布时间：2017-12-28 08:41

  本文关键词：RNAi抑制卡氏肺孢子TS基因表达的实验研究　出处：《重庆医科大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 卡氏肺孢子 RNAi 表达载体 超微结构

【摘要】： 在所有的真核、原核生物中,胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是一磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成途径的一个关键酶。dTMP是一磷酸脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)的甲基化产物,在dTMP的合成过程,TS催化dUMP甲基化生成dTMP。5,10-二甲基四氢叶酸是这个反应的甲基供体,它还是甲基反应的电子供体,由此可见TS是DNA合成和修复必要的酶。 RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是一种从低等生物到哺乳动物的保守的防御反应。双链RNA在细胞内被RNA酶Ⅲ(RNaseⅢ)酶切成约21-23nt的小片段干扰RNA(siRNA),进而形成siRNA-蛋白复合物,即RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC通过识别降解具有同源序列的信使RNA(messenger ribonucleicacid,mRNA),最终导致特异性的基因表达沉默。本研究通过自行构建能在大鼠卡氏肺孢子(pneumocystis carinii,PC)内转录出功能性siRNA的载体,并将其用于干扰TS基因的表达,为下一步基因功能和治疗手段的研究奠定基础。本研究共分为两个部分。 一、大鼠卡氏肺孢子TS基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定方法:人工合成针对PC TS基因的1对shRNA序列并定向克隆到siRNA(small interference RNA)真核表达载体pTZU6+1上,采用双酶切和测序法鉴定;结果:酶切和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致;结论:成功构建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶靶向shRNA的真核表达载体。 二、RNAi抑制大鼠卡氏肺孢子TS基因的体外实验研究方法:连续地塞米松腹股沟皮下注射Wistar大鼠6周诱导建立卡氏肺孢子肺炎动物模型;体外提取并纯化PC,将含有GFP的pTZU6+1质粒与Lipofectamine 2000分别按质量与体积比2∶2、2∶4、2∶6、2∶8转染至PC中,并分别在转染后24h、48h、72h在荧光显微镜下计数表达荧光的滋养体的数量;将质粒转染PC,在转染24h、48h、72h分别计数每视野包囊均数,转染48小时后通过RT-PCR测定TS基因mRNA水平的表达;并在转染后48h取标本作扫描电镜,观察重组质粒转染组和对照组PC超微结构的变化。结果:连续地塞米松皮下注射大鼠可诱导建立卡氏肺孢子肺炎动物模型;转染48小时后绿色荧光蛋白表达数量最多;转染48小时后重组质粒每视野包囊均数最少,且与空白组和空质粒组有明显差异;shRNA真核表达载体能有效抑制PC TS基因表达,与转染空载体组和空白组比较,TS基因mRNA表达减少至45.07%;转染48小时后PC表面出现损害主要为表面微绒毛脱落,残存微绒毛水肿呈球型,有的PC包囊表面损害严重,出现大小不等的孔洞。结论:Lipofecttamine2000对重组质粒有较强的转染效率;shRNA真核表达载体能有效抑制TS基因mRNA表达,并且对PC超微结构产生一定程度的破坏。
[Abstract]:Thymidylate synthase (TS) is a key enzyme in the synthesis of thymidine nucleotides (dTMP) in all eukaryotes and prokaryotes. DTMP is a methylation product of diphosphate deoxy uracil nucleotides (dUMP). In the synthesis process of dTMP, TS catalyzes the formation of dUMP methylation to produce dTMP. 5,10- two methylenetetrahydrofolate is the methyl donor of this reaction, and it is also the electron donor of the methyl reaction. This shows that TS is the necessary enzyme for the synthesis and repair of DNA.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346;R531.5

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本文编号：1345318