HIV-1主要抗原蛋白在毕赤酵母和大肠杆菌中的重组表达

发布时间：2018-04-15 16:00

  本文选题：HIV-1 + p24抗原　； 参考：《东北师范大学》2009年硕士论文

【摘要】： 人类免疫缺陷病毒(HIV)是造成艾滋病发生的病原体,自1981年美国报告首例AIDS以来,HIV已在全球迅速传播和扩散,其主要原因是基因组比较复杂而且变异程度高,这为诊断试剂和疫苗的研究带来了很大的难度。在机体感染HIV后,最先能检测到的是p24抗原,而后可以检测到外膜糖蛋白gp120和跨膜蛋白gp41等刺激产生的抗体。所以在新一代的HIV抗体诊断试剂盒中使用的包被抗原必须含多种组分,既要有HIV-1的核心抗原P24,还需要加入表面抗原gp120,gp41,HIV-2的表面抗原gp36等。考虑到HIV抗体诊断试剂中包被抗原的复杂性,因此本实验利用基因重组技术将编码p24蛋白基因整合到毕赤酵母GS115中,gp120和gp41编码基因分别导入到大肠杆菌BL21和M15中进行重组表达。 以质粒pT24为模板,PCR扩增出p24基因,以酵母分泌型表达载体pPIC9为载体,构建重组酵母表达质粒pPIC924。用限制酶SacI线性化后电转化毕赤酵母GS115,同酵母菌基因组重组,通过MM和MD培养基筛选在两种培养基生长良好的菌种后再经过PCR鉴定获得正确的酵母转化子,计算其整合率为83%,而且有很好的遗传稳定性。液体培养阳性转化子并用甲醇诱导重组蛋白的表达,表达产物以SDS-PAGE和Western blot进行分析,结果表明重组蛋白获得了正确的表达,产量为55.6mg/L。抗原蛋白经过离子柱纯化后应用间接ELISA法包被反应板,对阳性血清进行检测,结果表明酵母表达的重组p24抗原蛋白具有很好的抗原特异性。 选择gp120基因上抗原性较强的区段设计引物,PCR扩增出截短的外膜糖蛋白gp120基因,构建表达质粒p120s。将该重组质粒和pT41质粒分别转化大肠杆菌BL21和M15,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白。结果显示gp120s实现了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的17.9%。gp41以包涵体的形式表达,表达量占菌体的24.6%。包涵体经过洗涤和变性处理后,变性的包涵体蛋白复性效率是14.1%。利用镍柱亲和层析法对以上两种大肠杆菌表达的重组蛋白进行纯化,纯度分别为63.1%和89%。ELISA结果显示了重组抗原蛋白gp120s和gp41均具有良好的抗原性。 本论文在酵母和大肠杆菌两种表达系统中表达了HIV-1重要的抗原蛋白p24,gp120s和gp41,而且都具有较好的抗原特异性。这三种重组抗原蛋白可以为研究抗原蛋白的特性奠定基础,也为HIV-1诊断试剂和亚单位疫苗的开发提供了基础。
[Abstract]:Human immunodeficiency virus ( HIV ) is a pathogen causing AIDS . Since the first AIDS report in 1981 , HIV has spread and spread rapidly in the world . The main reason is that the genome is complicated and the degree of variation is high . It is the core antigen P24 of HIV - 1 .



The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI and then transformed into Pichia pastoris GS115 . The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI and then transformed into Pichia pastoris GS115 . The recombinant protein was transformed with restriction enzyme SacI . The recombinant protein was transformed by PCR . The results showed that the recombinant protein obtained the correct expression and the yield was 55.6 mg / L . The positive serum was detected by indirect ELISA and the positive serum was detected .



coli BL21 ( DE3 ) and pT41 ( pT41 ) were transformed into E . coli BL21 and M15 respectively . The results showed that gp120s was expressed in the form of inclusion bodies .



In this paper , HIV - 1 is expressed in both yeast and E . coli expression system , and it has better antigen specificity . These three kinds of recombinant antigen proteins can lay a foundation for studying the characteristics of antigen protein and provide the basis for the development of HIV - 1 diagnostic reagent and subunit vaccine .

【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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本文编号：1754798