细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果的研究

发布时间：2018-08-07 10:59

【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)感染患者自身抗HBV特异性细胞免疫状态是决定HBV感染自然史和转归的重要因素之一,探寻有效的免疫调节治疗手段来激活或增强慢性乙型肝炎(CHB)患者机体抗HBV特异性细胞免疫应答,以达到打破免疫耐受或提高现有抗病毒药疗效的目的,是目前慢性HBV感染防治领域研究热点,将成为今后抗病毒治疗策略调整的趋势。由于抗原的表达、修饰及合成在宿主细胞内进行,并通过MHC-Ⅰ类抗原复合物方式递呈,DNA疫苗能更有效诱导机体特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。因此,DNA疫苗具有传统疫苗所不具备的优势,在抗病毒性感染(如HBV、HIV)和肿瘤的基础及临床试验中都表现出良好的应用前景。然而,初步的临床试验结果表明,由HBV包膜中蛋白(PreS2+S)编码基因构建的DNA疫苗治疗慢性HBV携带者,HBV特异性IFN-γ分泌T淋巴细胞检出率及血清HBV DNA水平下降并不非常明显。影响该项基因治疗技术发展的最主要的困难是:(1)DNA疫苗质粒在宿主体内转染率比较低;(2)质粒的免疫原性不强。为了解决第一个问题,我们应用了在体电脉冲(EP)技术,成功地提高了HBVDNA疫苗在大体重动物比如非人灵长类动物中的转染率,并且能有效诱导体液免疫和细胞免疫应答。为解决第二个技术难题,我们设计构建了Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)融合蛋白基因表达质粒(pFP),用以增强DNA疫苗免疫接种局部抗原递呈细胞(APC)的抗原递呈功能,有助于促进Th1细胞分化并利于特异性体液免疫和细胞免疫应答的诱导。本项研究以BALB/c小鼠、新西兰家兔、非人类灵长类动物猴及HBV转基因(Tg)小鼠为动物模型和研究对象,评价和探讨pFP及EP分别增强和提高治疗性HBV DNA疫苗免疫原性及质粒宿主细胞内转染率的辅助效果和机理。第一章双质粒HBV DNA疫苗及在体电脉冲仪(EP)的研制和检定治疗性双质粒HBV DNA疫苗系采用基因重组技术构建的HBV包膜中蛋白(preS2+S)基因真核表达质粒(HBV DNA疫苗)联合佐剂质粒组成的双质粒治疗性DNA疫苗。在接种HBV DNA疫苗的同时,联合注射编码人白细胞介素融合蛋白(IL-2/IFN-γ)基因质粒作为佐剂,以辅助前者对机体免疫应答的诱导,使其激活的T细胞向Th1亚群分化,以期望更有效地诱导产生细胞免疫应答而打破因慢性HBV感染所导致的机体免疫耐受,达到清除病毒的治疗目的。本研究中,将编码HBV胞膜中蛋白的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1构建了重组pS2.S质粒。为增强其免疫原性,我们构建了IL-2/IFN-γ融合蛋白佐剂质粒pFP,它是由IL-2信号肽序列,IL-2全基因序列,24bp连接序列(编码AGSGGGGS)以及IFN-γ的全基因序列顺序连接在pCR的钝端构成。分子模拟根据pFP基因编码的IL-2和IFN-γ融合蛋白的一级结构进行。pFP所表达的蛋白的空间构象及与天然IL-2和IFN-γ构象的比较通过数字分子模型软件来(New Providence,PA)完成。用脂质体转染试剂转染COS-7细胞,以ELISA,增强化学发光法(ECL)-Western blotting检测转染细胞培养上清中目的基因表达,并分别以CTLL-2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法(WISH-VSV)检测pFP转染后不同时间点培养上清中IL-2及IFN-γ活性。双质粒转染COS-7细胞后24 h能检测到目的蛋白表达,48 h时蛋白表达达最高值,其中HBsAg、IL-2和IFN-γ的浓度分别为17.6,9.2,8.6μg/L,72,96 h时蛋白表达呈明显下降趋势。而转染空载体和未转染质粒细胞上清均未检测到HBsAg、IL-2和IFN-γ抗原活性。双质粒转染表达产物的ECL Westernblotting鉴定结果,对照组未转染细胞上清和转染空载体均未检测出任何阳性反应条带,而pS2.S及pFP分别在分子质量为30.6 kD及110kD处有特异性反应条带。根据pFP基因编码的IL-2/IFN-γ融合蛋白的一级结构模拟出其空间结构。表达IL-2/IFN-γ融合蛋白的空间结构能够和天然的IL-2、IFN-γ空间结构很好的对应起来,这表明8个氨基酸的连接物能够保证表达的IL-2和IFN-γ蛋白在空间折叠时互不影响,并能保证IL-2和IFN-γ的生物活性区域充分暴露在融合蛋白的表面。用IL-2和IFN-γ标准品作为对照,检测pFP转染细胞上清中的细胞因子活性实验结果表明,IL-2和IFN-γ具有生物学活性,转染后48 h时上清中IL-2和IFN-γ的活性分别为260和80.5 U/mL,为检测最高值,与相同样本来源的ELISA检测上清浓度的高峰值一致,这为质粒pFP在治疗性HBV DNA疫苗免疫过程中发挥佐剂作用的研究奠定了物质结构基础。在体电脉冲技术(EP)的电脉冲发生器和电极由上海交通大学药学院提供,可发射0-300V电压的方波信号,一个脉冲持续10μs-100 ms。两个针头用的是针灸治疗中所使用的针头,长1.2mm,直径0.3mm。两个针头距离1cm,分别代表阳极和阴极。以绿色荧光蛋白(GFP)及荧光素酶(LUC)编码基因作为报告基因,观察上述蛋白表达质粒(pGFP,pLUC)经EP导入小鼠胫前肌(TA)后目的蛋白的表达以及组织病理改变情况。结果显示,EP处理中央部位肌肉组织损伤较为严重,可观察到明显肌细胞溶解、坏死及炎症的发生,而边缘区损伤较轻微。早期质粒转染成功并表达目的基因产物的肌细胞以边缘区域为主,可观察到较强的绿色荧光信号。EP转染5天荧光信号为高峰并随时间的推移而逐步衰减,期间损伤严重的中央区域组织修复同时进行,至21天肌肉组织基本恢复正常并可观察到GFP阳性纤维的出现,系细胞核置于中央的再生肌纤维。pLUC转染小鼠TA实验结果,经EP介导的的8只BALB/c小鼠局部TA组织荧光素酶活性为16136.3±9588.7RLU,而同期未经EP介导的对照组酶活性仅为8.0±8.0RLU,组间相差4个数量级,差异具非常显著性(t=4.757,P=0.002)。第二章pFP增强DNA疫苗免疫原性的实验研究观察佐剂质粒(pFP)以不同剂量和给药方式联合DNA疫苗(pS_2·S)应用诱导机体体液免疫(血清抗-HBs水平)的效果,摸索出最适的免疫接种方法(包括免疫剂量、双质粒配伍和给药途径),以提高DNA疫苗的体内免疫效果并为下一步确定细胞免疫实验中动物接种方式提供参考。 2.1 pFP联合HBV DNA疫苗免疫诱导体液免疫结果三个不同剂量的HBV DNA疫苗(pS2.S)单独免疫BALB/c小鼠后血清抗—HBs水平及阳性数观察结果,大(100μug/只)、中剂量组(50μg/只)初次免疫2周时分别为86.0±46.6mIU/ml,45.8±26.0mIU/ml并可诱导组内全部动物抗体水平呈阳性,而低剂量组(10μug/只)水平为16.2±9.3mIU/m,组内抗体阳性数仅为3只(每组5只)。4、8、14周时各组抗体水平均有升高,但高、中剂量组升高较低剂量组更为明显。然而,低剂量(10μug/只)的pS2.S与相同剂量的pFP联合免疫2、4周时血清抗体水平分别为115.9±19.4mIU/ml、130.1±29.5 mIU/ml,组内全部5只小鼠2周时抗体水平呈阳性;pFP剂量升高未能增强pS2.S的免疫效果,其剂量为50ug/只,100 ug/只时联合pS2.S接种免疫效果明显降低,连同对照组[pS2.S+pcDNA3.1,10+10(ug/只)]较低剂量组[pS2.S+pFP,10+10(ug/只)]2周或4周时水平差异具显著性(P＜0.05)。低剂量(1 ug/只,5 ug/只)的pFP虽未明显减低血清抗体水平,但检测值的均一性较差,且2,4周时未能诱导出组内全部动物抗体水平呈阳性。为考察pFP(ug/只)接种时间和部位对联合pS2.S(ug/只)免疫效果的影响,分别设置同时接种(Ⅰ组:pS2.S+pFP)、pFP于pS2.S免疫前3日接种(Ⅱ组:pFP+3d+pS2.S)、pFPpS2.S免疫后3日接种(Ⅲ组:pS2.S+3d+pFP)及pFP与pS2.S分左右腿胫前肌(TA)接种(Ⅳ组:pS2.S/TA+pFP/TA)四组,比较pS2.S免疫2周,4周时血清抗体水平及阳性数。结果显示Ⅰ组免疫效果最佳,表现为抗体水平较高、检测值个体差异较小,仅该组与Ⅳ组水平比较差异具显著性(P＜0.05),且其组内全部小鼠抗体水平均呈阳性。据此pFP联合pS2.S免疫方式,观察二者高[10+10(μg/只)]、中[10+10(μg/只)]、低剂量[10+10(μg/只)]联合免疫效果显示,高、中剂量组2、4周时均能诱导组内全部动物抗体水平呈阳性,二组4周时抗体水平较低剂量组升高明显,差异具显著性(P＜0.05)。 2.2 pFP联合pS2.S诱导细胞免疫应答结果 pFP(50μg/只)联合pS2·S(50μg/只)免疫组小鼠脾细胞体外经HBsAg刺激培养上清IL-2/IFN-γ水平(263.5±52.0/38.4±11.9pg/ml)较同剂量的pS2·S;联合空载体pcDNA3.1免疫组(149.6±22.2/10.1±4.3pg/ml)高,差异具显著性(P＜0.01);IL-4水平于各组质粒免疫影响不明显。 pS2.S+pFP免疫组小鼠局部引流淋巴结(LN)中单核巨噬细胞(MPs)计数及其占LN细胞的百分比结果(18.0×10~5,8.2%)明显高于pS_2·S+pcDNA3.1组(8.0×10~5,5.2%)及空载体免疫组(6.7×10~5,2.8%);同时,pS2.S+pFP免疫组MPs能明显刺激HBsAg致敏的T细胞增殖,其T细胞增值指数(SI:5.60)较pS2·S+pcDNA3.1组(2.55)及pcDNA3.1组(1.80)高。 HBV DNA疫苗诱导小鼠特异性CTL活性结果,HBV DNA疫苗免疫诱导小鼠CTL活性的强弱与效/靶(E/T)比例及其上清液中IFN-γ分泌水平有一定关系。E/T为90:1及30:1时,联合佐剂质粒免疫组(pS_2·S+pFP)CTL活性(细胞溶解率:52.5%,43.3%)较pS_2·S+pcDNA3.1组(45.4%,27.1%)高;E/T=10:1时,pS_2·S+pFP组仍有CTL免疫活性(＞20%),而pS_2·S+pcDNA3.1组CTL活性＜20%,实验过程中空白载体pcDNA3.1对照组CTL活性于任一E/T比例条件下均＜20%。抗原特异性分泌IFN-γ或IL-4T细胞ELISPOT检测结果,pS_2·S+pFP免疫健康BALB/c小鼠6周后,脾细胞在体外用HBsAg刺激后其诱生的IFN-γ细胞频数(27.88±11.93 SFCs/3×10~5脾细胞),较同期对照组用空载体pcDNA3.1(1.43±1.51 SFCs/3×10~5脾细胞)高,差异据非常显著性(t=6.211,P＜0.001)。脾细胞在体外用HBsAg刺激后其诱生的IL-4细胞频数(5.00±2.00 SFCs/3×10~5脾细胞)较不用HBsAg组(2.00±1.10 SFCs/3×10~5脾细胞)高,但差异没有显著性(t=1.20,P＞0.05)。经流式细胞术(FACS)实验分析,pS2.S+pFP免疫组诱导小鼠胞内分泌IFN-γ的CD4~+ T细胞百分比(0.28±0.17%)与pcDNA3.1对照组(0.20±0.03%)比较,无显著性差异(P＞0.05,t=0.130);而其诱导小鼠胞内分泌IFN-γ的CD8~+ T细胞表达IFN-γ百分比(0.69±0.08%)较对照组(0.24±0.12%)高,差异具显著性(P＜0.001,t=4.167)。 2.3不同细胞因子表达质粒联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性免疫应答结果为进一步说明和证实IL-2/IFN-γ融合蛋白表达质粒(pFP)设计的合理性及作为佐剂增强pS2.S免疫原性的有效性,通过基因克隆及重组技术分别设计和构建了鼠源性IL—2(pmIL-2),IFN-γ(pm IFN-γ)及IL-2/IFN-γ融合蛋白表达质粒(pmFP)作为佐剂,并以其小剂量(5μg/只)联合pS2.S(5μg/只)接种BALB/c小鼠,并对各自诱导的免疫应答阳性数进行观察比较。结果显示,pmIL-2+pmIFN-γ[(2.5+2.5)μg/只]联合pS2.S免疫诱导HBsAg-特异性体液免疫和细胞免疫效果最佳,并与相同剂量的pS_2·S+pFP组效果相当,主要表现为其组内诱导的特异性分泌IFN-γT细胞阳性反应动物数目与单独使用细胞因子质粒(pmIL-2或pm IFN-γ)及pmFP免疫组(未获得阳性应答)具本质性差别,提示IL-2及IFN-γ质粒作为免疫佐剂在增强HBV DNA疫苗免疫效果上具有协同效应。而鼠源性融合蛋白(pmFP)在本实验中未显示出佐剂效应,推测可能与其构建时所选用的连接肽基因(与人源性pFP相同)未能在融合蛋白分子结构上保持IL-2及IFN-γ各自活性有关。第三章在体电脉冲法提高HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究本研究以新西兰家兔、恒河猴及食蟹猴为实验对象,观察评价EP通过提高裸DNA质粒在宿主体内细胞导入率,增强HBV DNA疫苗诱导大体重动物特异性免疫应答效果。另采用高水力学注射法(hydrodynamic injection或水力注射法)将质粒pS2.S转染至BALB/c小鼠肝细胞内作为模型,观察EP介导的pS2.S免疫对该模型小鼠肝细胞HBsAg表达的抑制效果。 3.1 EP联合接种HBV DNA疫苗诱导兔和猴特异性免疫应答结果整个实验整个观察过程,未经EP介导的高剂量[(1000+1000)μg/只]双质粒HBV DNA疫苗(pS2.S+pFP)免疫组内各只动物(家兔或猴)血清抗-HBs均为阴性水平(＜10mIU/ml)。 (1)经EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫于新西兰家兔实验结果:2周时大剂量(50+50μg/只)及中剂量组(25+25μg/只)分别有3/5只,1/5只动物血清抗-HBs水平呈阳性(＞10 mIu/ml)至4周时阳性数虽无变化,但二组水平均明显升高。第1次免疫后13周(即第10周增强免疫后3周)时,EP介导的大、中、小剂量组动物均有血清抗-HBs阳性出现,分别为5、4与4只,其中大剂量组阳性数与同期对照组比较,差异具有显著性(P=0.008)。 (2)EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫恒河猴实验结果:初次免疫后8周(即第1次增强免疫后4周)时,大、中剂量组,分别有3及2只动物血清抗-HBs阳性,至免疫后13周(即第2次增强免疫后3周)时,大、中、小3个剂量组全部3只动物血清抗-HBs为阳性。 (3)EP介导的双质粒HBV DNA疫苗免疫食蟹猴免疫实验结果:中剂量组(660μg/kg)接种后第6周即有1动物血清中测出较高滴度的抗-HBs;随着接种次数增加,血清抗-HBs阳性的动物数量也随之增加,至16周时低(200μg/kg)、中剂量组内全部动物血清抗体呈阳性,而高剂量组(2000μg/kg)阳性数为2/6只;各组血清-HBs水平高峰期大约在23～25周之间,随后小幅下降。16周时EP介导的HBV DNA疫苗免疫高、中、低剂量组各3只食蟹猴中分别有3、2、3只HBsAg特异性IFN-γT细胞计数阳性;29周时高、中、低剂量组全部动物应答呈阳性,其计数结果分别为30.0±13.5 SFCs/3×10~5 PBMCs,30.7±26.3 SFCs/3×10~5 PBMCs及17.7±6.4 SFCs/3×10~5 PBMCs;而相同时间佐剂组和PBS对照组3只食蟹猴均为阴性。 3.2 EP介导的HBV DNA疫苗免疫对小鼠肝内HBsAg表达水平的影响小鼠经水力学法注射pS2.S后12小时(hr.)即可检测出HBsAg表达(78.5±11.7ng/ml),24hr.肝内HBsAg表达为高峰期(108.5±21.5 ng/ml),以后表达量随时间而降低。EP(pS2.S+EP)与未经EP介导(pS2.S/IM)的HBV DNA疫苗免疫后的小鼠肝组织HBsAg水平均有不同程度的降低,pS2.S/IM组12hr.(44.8±16.6 ng/m),72hr.(15.1±3.7 ng/ml)HBsAg水平较同一时间未免疫对照组(78.5±11.7ng/ml,22.8±4.5 ng/ml)低,差异具非常显著(P＜0.01)及显著性(P＜0.05);pS2.S+EP组于12hr.(8.3±0.6 ng/ml),24hr.(9.9±4.1ng/ml)及72hr.水平(3.3±0.3ng/ml)较同期对照组(78.5±11.7ng/ml,108.5±21.5 ng/ml,22.8±4.5 ng/ml)低,差异具非常显著性(P＜0.01),较同期pS2.S/IM组(44.8±16.6 ng/m,96.3±34.3 ng/ml,15.1±3.7 ng/ml)水平低,差异亦具非常显著性(P＜0.01)。免疫组化计数HBsAg染色阳性细胞结果,pS2.S+EP组于观察期间各个时间点阳性染色肝细胞数目均较对照组少,差异分别具显著(2、5、7天,P＜0.05)及非常显著性(12hr.、1天、3天,P＜0.01)。观察肝组织病理及血清转氨酶(ALT)水平变化结果发现,动物经水力注射转染pS2.S后肝组织病理无明显改变,尽管血清ALT呈现短暂性升高,但各时间点上pS2.S+EP与对照组比较无显著性差异。第四章pFP联合EP提高治疗性HBV DNA疫苗效果的评价本研究以健康BALB/c小鼠及HBV转基因(Tg)小鼠为研究对象,分别比较分析和系统研究pFP、EP单独和二者联合应用增强HBV DNA疫苗体液免疫及细胞免疫效果的辅助作用,探寻最佳的接种组合方式及给药剂量。在此基础上,进一步评价和探讨联合免疫增强HBV Tg小鼠细胞免疫及促进病毒应答的治疗效果及初步作用机理。 4.1健康BALB/c小鼠免疫应答效果 (1)血清抗-HBs抗体水平检测:EP介导的DNA疫苗免疫组间比较,A组(pS2.S+pFP+EP)血清抗-HBs水平为51.2±50.0 mIU/ml,血清阳性率为89%,B组(pS2.S+pcDNA3.1+EP)血清抗HBs抗体水平为14.8±7.6 mIU/ml,血清阳性率为64%。A组血清抗-HBs水平及血清阳性率均高于B组(P=0.033,P=0.026)。pFP及非pFP(pcDNA3.1)联合DNA疫苗免疫组间血清抗体阳性率比较,即A组与C组(pS2.S+pFP+pEP)及B组与D组(pS2.S+pcDNA3.1+pEP)比较,差异均具显著性(P=0.000);同时,EP与pFP各自增强血清抗体应答阳性率比较(B组vs.C组)差异亦具显著性(P=0.001)。 (2) HBsAg特异性T细胞免疫应答水平检测:在EP或非EP(pEP)介导pS2.S免疫反应比较中,B组(pS2.S+pcDNA3.1+EP)和D组(pS2.S+pcDNA3.1+pEP)以pcDNA3.1质粒代替了A组(pS2.S+pFP+EP)、C组(pS2.S+pFP+pEP)的pFP,结果B、D组的HBsAg特异性细胞免疫应答水平及阳性率(B组:84±70 SFCs/3×10~5脾细胞,28%;D组:17±29 SFCs/3×10~5脾细胞,11%)较相对应的A、C组(A组:207±103 SFCs/3×10~5脾细胞,78%;C组:156±126 SFCs/3×10~5脾细胞,50%)低,其中A、B二组阳性率差异经统计分析具有显著性(P=0.007)。而细胞计数(SFCs/3×10~5脾细胞)结果经异方差多组内两组间多重统计分析比较,仅A组与D组比较差异具有显著性(P=0.025)。研究结果表明,EP以提高HBV DNA疫苗体液免疫应答效果最为明显,其辅助作用较pFP强;而在本研究中仅pFP能显示出明显增强DNA疫苗诱导的细胞免疫效果的佐剂作用。因此,我们认为EP联合pFP在HBV DNA疫苗免疫(即A组:pS2.S+pFP+EP)能获得最佳的体液和细胞免疫应答效果。以上述组合方式接种不同剂量的HBV DNA疫苗,结果显示具有一定的剂量依赖性,为进一步的HBV Tg动物模型实验有效剂量的选择奠定了实验基础。 4.2 HBV Tg小鼠模型实验结果 (1) HBV DNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周(13317±2539拷贝/ml)、12周时(6462±3359拷贝/ml)分别较免疫前(36159±7769拷贝/ml)明显减低,差异具非常显著性(P＜0.01);pS2.S+pcDNA3.1组4周(20618±9523拷贝/ml)及8周时(23818±5319拷贝/ml)均较其免疫前水平(36090±4421拷贝/ml)明显降低(P＜0.01),但不能持续到12周时(27691±13071拷贝/ml),并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异具非常显著性(P＜0.01)。 (2)病毒应答与细胞免疫应答的平行比较:各组Tg小鼠血清HBsAg水平无明显变化,但肝脏免疫组化结果显示,HBsAg表达水平存在差别。pS2.S+pFP和pS2.S+pcDNA3.1组分别有4只和2只HBV Tg小鼠肝组织切片HBsAg表达阳性的肝细胞低于观察视野总计数细胞的25%,pcDNA3.1对照组Tg鼠HBsAg表达阳性的肝细胞均在25%以上。pS2.S+pFP组3只(3/5)ALT升高(≥2×ULN),pS2.S+pcDNA3.1组和pcDNA3.1组均只有1只检测到ALT活性升高。pS2.S+pFP组HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数(46.02±6.3SFCs/3×10~5个脾细胞)亦多于pS2.S+pcDNA3.1(19.4±10.3SFCs/3×10~5个脾细胞)或pcDNA3.1组(14.0±8.9SFCs/3×10~5个脾细胞),其中pS2.S+pFP组较pcDNA3.1组差异具显著性(P＜0.05,t=2.571),且三组动物个体观察结果发现HBsAg特异性SFCs的升高与血清ALT基本一致,并伴随着血清HBV DNA及肝组细胞HBsAg表达水平的降低。本研究结果表明,pFP能够显著增强EP介导的HBV DNA疫苗免疫H BVTg的治疗效果,表现为pFP联合免疫能持续性抑制HBV DNA的复制及表达。EP的引用大大降低了质粒的有效接种剂量。观察终点(12周)时,pFP联合HBV DNA疫苗免疫组Tg小鼠血清HBV DNA水平显著低于DNA疫苗单独免疫及对照组,个体血清HBV DNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。值得注意的是,DNA疫苗免疫组肝脏细胞空泡样变较对照组明显,可能与DNA疫苗免疫所介导的HBV特异性或非特异性免疫应答造成的肝脏炎症损伤有关。由于小鼠动物模型基础上研究外周血单个核细胞(PBMC)免疫应答水平的局限,本文结果中病原学与免疫学应答相关性的研究仅限于观察结束的一个时间点上,但所要提示的与近年来文献报道结论基本一致,即HBV的清除与溶细胞或非溶细胞性免疫应答有关。综上所述,Th1型细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白编码基因质粒(pFP)联合HBV DNA疫苗(pS2.S)接种能有效增强pS2.S的免疫效果,pFP与pS_2S剂量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳;在体电脉冲(EP)技术通过提高质粒DNA体内细胞转染率,有效增强HBV DNA疫苗在各种动物(包括非人类灵长动物)诱导的免疫效果;pFP通过加强初始T细胞向Th1方向分化,能够增强HBVDNA疫苗免疫的治疗性作用,与EP联合HBV DNA疫苗治疗HBV Tg小鼠后,能在一定程度上抑制Tg小鼠HBV DNA复制和HBsAg表达。以上研究结果有益于目前DNA疫苗及裸质粒基因治疗技术瓶颈性难题的解决,并为寻找更有效的抗HBV感染免疫治疗策略提供新的技术途径和实验依据。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】