人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化的体外研究

发布时间：2018-11-12 09:13

【摘要】： 目的探讨人脐带间充质干细胞分离、培养的方法,研究其基本生物学特性。初步探讨人脐带间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的方法。 方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,利用PBS冲洗脐动脉及脐静脉,将血液冲洗尽,将其剪碎至1mm~3后,加入Ⅳ型胶原酶(0.1%)消化60min,然后加入胰酶(0.125%)消化30min,利用滤网过滤后收集细胞,DMEM(5%FBS)重悬细胞接种于培养瓶内进行原代培养,待细胞生长至80-90%融合后进行1:3传代培养,取传代培养细胞进行形态学观察、免疫细胞化学染色、流式细胞仪检测、生长活性、细胞周期分析、染色体数目分析及软琼脂克隆形成实验。进一步取第6代细胞经胰酶消化后接种于12孔板中,待细胞生长至约70%融合后,利用两步诱导法进行诱导,对照组用原培养液培养。诱导组中加入0.5μM/L地塞米松,50 g/L ITS,20μg/L HGF,10μg/L FGF4,烟碱0.61g/L,共10天。后期加入20μg/L OSM,0.5μM/L地塞米松,50 g/LITS。每3d换液1次,在不同诱导阶段收集细胞后观察细胞形态,免疫细胞化学,RT-PCR,糖原染色。 结果利用胶原酶及胰酶两步消化法能充分消化脐带,细胞易于获得,收集细胞后进行原代培养,24小时可观察到贴壁细胞,待生长至10天时可见细胞长满瓶底,进行传代培养,每周传代1次。观察细胞形态为长梭形,不规则形,细胞大小不一,类似成纤维细胞,呈漩涡样生长。取第6-9代细胞行免疫细胞化学染色结果显示细胞强表达CD105、Vimentin,基本不表达CD34、CD31、CD133。经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD105,基本不表达造血细胞标志CD34。MTT实验显示细胞倍增时间为22h。细胞周期分析表明75%-85%细胞处于G_0/G_1。染色体分析可见细胞染色体条数正常。在软琼脂中无克隆形成。经诱导后的细胞在培养到第14d可见细胞形态出现变化,细胞长突起逐渐消失,逐渐转为圆形或卵圆形,经免疫组化检测可见细胞在第1周开始表达AFP,第2周时CK18、CK19、OV6的表达被观察到。在诱导第3周时ALB表达被观察到,AFP表达逐渐减弱。到第4周AFP的表达基本消失,ALB的表达增强。RT-PCR结果显示细胞于第1周开始表达AFP,至诱导后期,AFP表达水平逐渐降低。于第3周时观察到ALB表达,随时间延长ALB表达逐渐增强。于第4周糖原染色呈阳性结果。 结论:经酶消化法可从脐带中获得间充质干细胞,易于获得,体外增殖能力强,与骨髓来源间充质干细胞的免疫表型相一致,符合间充质干细胞基本的生物学特性,有望在干细胞的研究及临床应用方面发挥重要的作用。脐带间充质干细胞在本实验诱导条件下可转化为肝样细胞,表达肝细胞的表面标志,初步具备肝细胞特有的功能性特征,将为肝细胞组织工程提供理想的细胞来源。
[Abstract]:Objective To study the isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to study its basic biological characteristics. The method of inducing differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells to liver-like cells was discussed. Methods The umbilical cord of the newborn was collected under aseptic condition. The umbilical artery and the umbilical vein were washed with PBS. The blood was washed with PBS. The umbilical vein and the umbilical vein were washed. After the blood was cut to 1mm ~ 3, type 鈪，

本文编号：2326687