幽门螺杆菌H.pylori尿素通道蛋白UreI基因疫苗的初步研究

发布时间：2018-12-27 19:43

【摘要】： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是人类最常见的致病菌,其感染与人慢性活动性胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤和胃腺癌等有重要关系。H.pylori是唯一能在胃内酸性环境定植的细菌。在酸性环境下,尿素通道蛋白(UreI)激活尿素酶分解尿素产生氨,而氨的生成是H.pylori对抗胃酸、耐受胃酸以及在胃内定植的基础,因此UreI是H.pylori在胃内定植最关键的一个环节。H.pylori持续感染状态与H.pylori UreI有重要的关系,抑制UreI的表达,从而抑制尿素跨膜转运,使H.pylori对酸不耐受,进而不能在胃内强酸环境中定居,达到根除H.pylori及其相关性疾病的目的,因此以UreI为抗原的H.pylori疫苗将具有广阔的应用前景。本研究应用基因重组技术构建H.pylori UreI基因原核及真核表达载体,再转化/染表达菌/细胞,使其表达具有活性的大量的能够分泌到细菌/细胞外的UreI蛋白,观察其免疫性,研究H.pylori UreI的作用机理,探讨其作为基因疫苗的可行性。第一部分:H.pylori UreI编码基因的原核重组载体的构建、表达及其抗原性研究 1. pET32a(+)/UreI原核重组载体的构建及其在E.coli BL21中表达目的:构建H.pylori UreI编码基因的重组载体,并在E.coli BL21中表达。方法:利用分子克隆技术以H.pylori DNA染色体为模板,扩增H.pylori UreI编码基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpn I和Hind Ill双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化E.coli BL21,以IPTG诱导BL21/pET32a(+)/UreI融合蛋白表达。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot进行分析。结果:经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为H.pylori UreI编码基因,由585bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;Western blot分析显示,该重组融合蛋白能够被6His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。 2. pQE30/UreI原核重组载体的构建及其在BL21中表达目的:将H.pylori UreI编码基因,与质粒pQE30连接,并在BL21中表达。方法:从原核表达质粒pET32a(+)/UreI中,酶切并胶回收目的基因UreI,将其与同样进行酶切、纯化的载体pQE30进行连接,转化并筛选含有目的基因的重组载体pQE30/UreI,并在BL21中表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,12%SDS-PAGE及Western blot法检测其表达产物。结果:经单、双酶切证实重组载体插入的基因片段为H.pylori UreI编码基因,重组质粒pQE30/UreI表达的目的蛋白约为21KD,可溶性表达产物占全菌总蛋白的20%以上,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达90%。目的蛋白可被6His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。第二部分:H.pylori UreI编码基因的真核重组载体的构建及表达目的:构建H.pylori UreI编码基因的真核表达载体,并在COS-7中表达。方法:以重组质粒pET32a(+)/UreI为模板,PCR扩增UreI基因片段,将目的基因UreI和真核表达载体pEGFP-N1分别经Hind III和kpn I双酶切,纯化后进行连接。筛选阳性重组载体pEGFP-N1/UreI,转染COS-7细胞,免疫荧光法检测其表达产物及Western blot分析其抗原性。结果:成功构建了重组载体pEGFP-N1/UreI,经免疫荧光分析显示重组质粒pEGFP-N1/UreI在真核细胞中得到了表达,Western blot分析显示,该重组蛋白具有良好的抗原性。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【共引文献】