幽门螺杆菌对促凋亡基因PUMA表达的影响

发布时间：2019-01-06 09:37

【摘要】： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.Pylori)是定植在人胃粘膜上革兰染色阴性的微需氧菌,其感染是诱发人胃粘膜病变的主要因素之一,在世界范围内约有50%人群感染H.Pylori。世界卫生组织已将其列为一类致癌源,但其与胃癌发生机制尚未完全明确。 PUMA(P53正向细胞凋亡调控因子)是新近发现的bcl-2家族BH-3亚家族中的促凋亡成员,在p53依赖和非依赖途径的细胞凋亡启动与肿瘤发生过程中都发挥着重要作用。该基因定位于19q,cDNA全长1.9 kb,编码一个全长为193个氨基酸残基的蛋白。PUMA基因具有4个外显子(1a或1b,2,3,4)和三个内含子,转录后形成四种不同的剪接体(PUMA-α,-β,-γ及-δ)。目前PUMA四种剪接体在肿瘤细胞中的表达分布及功能尚不清楚。本论文的目的是研究PUMA基因四种剪接体在胃癌组织及细胞中的表达特点,以及不同H.Pylori菌株(溃疡及胃癌菌株)对胃癌细胞(BGC-823)及人正常胃上皮细胞(GES-1)中PUMA基因四种剪接体表达变化的影响,并初步探讨H.Pylori对PUMA基因的作用机制以及与胃癌发生的关系。方法:1.利用半定量逆转录聚合酶链反应检测胃癌组织、癌旁组织及不同胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901细胞中四种剪接体的mRNA表达水平,对PCR产物进行克隆和测序分析。2.从人胃粘膜组织中分离不同的幽门螺杆菌菌株,分别与BGC-823或GES-1细胞共培养,提取细胞总RNA,在不同时间点测定PUMA基因四种剪接体表达的变化。3.MTT法分析H.Pylori刺激后细胞增殖抑制情况。4.应用JC-1荧光染料法检测不同H.Pylori菌株刺激BGC-823或GES-1细胞后线粒体膜电位的变化。5.同时,采用荧光定量PCR法检测p53基因表达的变化,探讨与PUMA四种剪接体在H.Pylori刺激后表达变化的相关性。结果:1.PUMA四种剪接体经PCR扩增,并进行克隆测序后与GenBank中序列进行同源性比较,证实为PUMA-α,-β,-γ,及-δ,同源性均在99%以上。PUMA-α和-β在癌旁组织中表达阳性,但在癌组织中表达难以检测,差异显著(P＜0.05);PUMA-γ和-δ在癌旁及癌组织中均可见表达,且在癌旁组织中的表达量显著高于癌组织(P＜0.05)。PUMA-α,-γ及-δ在胃癌不同分化程度的细胞系BGC-823(低分化)及SGC-7901(中分化)中均有表达,但两细胞系间无统计学差异。而PUMA-β在BGC-823中的表达明显高于SGC-7901细胞(P＜0.05)。2.两种H.Pylori菌株刺激BGC-823细胞后与未刺激组相比,3个时间点(3 h、6 h及9 h)PUMA剪接体mRNA相对表达量均下调(P＜0.05),但四种剪接体表达变化各有特点:PUMA-β在两种H.Pylori菌株刺激后mRNA都难以检测到;在溃疡菌株刺激组,PUMA-α在6 h时下调最显著,-γ在3个时间点表达量降低的百分比无明显差别;而-δ在9 h时下调较明显。而在胃癌菌株刺激组,-α在3 h,-γ在3 h、6 h,-δ在9 h未检测到表达。3.两种H.Pylori菌株刺激GES-1细胞后结果显示:溃疡型刺激后PUMA剪接体在初期表达上调,9 h时表达又下调。而胃癌型的H.Pylori作用于GES-1细胞后发现:与对照组相比,在3 h时PUMA剪接体表达下调,而6 h,9h时又有恢复趋势。4.MTT法检测H.Pylori刺激前后BGC-823或GES-1细胞增殖抑制情况显示两种菌株对BGC-823细胞均有增殖作用;而对于GES-1细胞而言,溃疡菌株先诱导凋亡后又促进增殖。胃癌菌株则促进GES-1细胞增殖。5.JC-1荧光染色法检测提示两种菌株对BGC-823或GES-1细胞均促进增殖。6.荧光定量PCR结果显示与未刺激组相比,不同H.Pylori菌株刺激BGC-823细胞9 h后p53基因表达均显著性上调(P＜0.01),而3 h,6 h时却无明显变化;两种菌株刺激GES-1细胞后与未刺激组相比,p53基因在3个时间点表达都上调(P＜0.05),且有较好的时效关系(r_(溃疡型)=-0.978,r_(胃癌型)=0.943,P＜0.01)。结论:1.PUMA四种剪接体在胃癌组织中的表达下调,与癌的发生呈负相关;PUMA-β的表达还可能与细胞的分化程度有关。2.在BGC-823细胞中,H.Pylori可促进细胞增殖,并显著下调PUMA剪接体的表达,这种下调作用与p53无关。PUMA的表达与细胞增殖负相关。3.溃疡型H.Pylori对GES-1细胞先诱导凋亡后又促进增殖;PUMA剪接体的变化与细胞增殖变化一致;p53在刺激早期表达迅速上调,之后表达逐渐下降,与PUMA具相似的趋势,提示在胃上皮细胞中PUMA的表达可能依赖于p53的表达水平。4.胃癌型H.Bylori对GES-1细胞具有促增殖作用;对PUMA的表达先抑制后又恢复,而对p53的表达则有促进作用。在胃上皮细胞中,胃癌型H.Pylori对PUMA剪接体的作用可能与p53有关。综上所述,不同类型H.pylori对细胞的刺激所产生的效果不一致,胃癌型H.pylori促进细胞增殖的作用更明显。
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【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】