硫化氢对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2019-07-17 14:56

【摘要】： 目的:观察硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对内皮细胞凋亡的影响,并从抗氧化的角度初步探讨其作用的机制。 方法: 1.人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分别经不同浓度(25、50、100、200μmol /L)和不同时间(6、12、24h)硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)预孵育24h后加入100μg/ml氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,oxLDL)处理24h,以空白组和100μg/ml oxLDL处理24h组作为对照,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态的变化;碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡; 2.实验分为四组:①对照组:含10%胎牛血清RPMI-1640培养基;②NaHS+oxLDL组:50μmol /L NaHS孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h;③oxLDL处理组:100μg/ml oxLDL孵育HUVECs24h;④NAC+oxLDL组:1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC,抗氧化剂)孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h。双氢罗丹明123(Dihydrohodamine 123, DHR123)染色后,镜下观察和FCM测定HUVECs的DHR123荧光强度,以明确细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的变化情况;罗丹明123(Rhodamine 123, Rh123)染色后,镜下观察和FCM测定HUVECs的Rh123荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化情况;Western Blot检测细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白质的表达。 结果: 1. H2S抗oxLDL诱导的HUVECs凋亡 ①Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,与正常对照组相比, oxLDL (100μg/ml)处理组HUVECs中出现大量的核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞,而NaHS不同浓度(25、50、100、200μmol /L)和不同时间(6、12、24h)预处理的HUVECs中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光。 ②FCM结果显示,与正常对照组相比,oxLDL(100μg/ml)处理组细胞凋亡率明显增加(p 0.01),而不同浓度(25、50、100、200μmol /L)NaHS预处理组较oxLDL(100μg/ml)处理组细胞凋亡率分别降低80%、85%、89%、92%(均p 0.01);不同时间(6、12、24h)NaHS预处理组较oxLDL(100μg/ml)处理组细胞凋亡率分别降低80%、81%、84%(均p 0.01),50、100、200μmol /L NaHS预处理24h抗凋亡作用最明显。 2.H2S抗oxLDL诱导的HUVECs凋亡的作用机制 ①HUVECs经DHR123染色后,荧光显微镜观察发现,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的DHR123荧光强度明显增强,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml继续孵育24h的HUVECs DHR123荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组明显减弱;FCM定量分析结果显示,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的DHR123平均荧光强度升高了2.3倍(p 0.05),50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理HUVECs 24h的DHR123平均荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组分别降低了63%和67%(均p 0.05)。表明H2S对oxLDL诱导的细胞内ROS的生成具有抑制作用。 ②HUVECs经Rh123染色后,荧光显微镜观察发现,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的Rh123荧光强度明显减弱,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml继续孵育24h的HUVECs Rh123荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组明显增强;FCM定量分析结果显示,oxLDL处理组HUVECs的Rh123平均荧光强度较对照组降低56%(p 0.05),50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理HUVECs 24h的Rh123平均荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组分别升高104%和126%(均p 0.05)。表明H2S对oxLDL降低HUVECs的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot结果显示,100μg/ml oxLDL孵育HUVECs 24h后,与正常对照组相比,Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达分别增加29%和24%;50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理组与oxLDL处理组相比HUVECs的Caspase-3、Caspase-9蛋白表达分别降低19%、20%或12%、19%(均p 0.05)。oxLDL引起
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图片说明： 5 μmol /L NaHS 预处理组可见少量浓染致密的细胞核（图1B），其余浓度的 NaHS 预处理组细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀的低强度荧光（图 1C,D,E），说明 NaHS 预处理明显减少了 oxLDL 诱导的细胞凋亡。ABC DE F图 1 不同浓度H2S 预处理对oxLDL诱导HUVECs凋亡核形态的影响15
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图片说明： 图 2 不同浓度H2S 预处理对oxLDL诱导HUVECs凋亡率的影响CON：Control 组（0.5±0.9%）；25 μM：25μmol /L NaHS 预处理+100 μg/ml oxLDL 处理组（2.6±0.8%） ；50 μM：50μmol /L NaHS 预处理+100 μg/ml oxLDL 处理组（1.9±0.9%） ；100 μM：100μmol /L NaHS 预处理+100 μg/ml oxLDL 处理组（1.5±1.2%） ；200 μM：200μmol/L NaHS 预处理+100 μg/ml oxLDL 处理组（1.0±0.7%） ；oxLDL：100μg/ml oxLDL 处理组（13.1±1.5%）（n=3， ±s ，*p<0.05，** p<0.01，与 Control 组相比，，## p<0.01，与 oxLDL 组相比）3.1.3 NaHS 预处理不同时间对 oxLDL 诱导 HUVECs 凋亡核形态的影响正常组的细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀的低强度荧光（图 3A）；100 μg/mloxLDL 处理组 HUVECs 中出现大量的核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞（图 3E）；50 μmol /L NaHS 预处理 6h 和 12h 组可见少量细胞凋亡（核呈浓染致密的固缩形态），50 μmol /L NaHS 预处理 24h 组细胞染色质分布均匀，
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Hydrogen sulfide ameliorates vascular calcification induced by vitamin D3 plus nicotine in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年03期

本文编号：2515504