TRPC3在脂多糖诱导星形胶质细胞活化中作用

发布时间：2019-11-03 11:07

【摘要】： 星形胶质细胞(Astrocyte)是中枢神经系统(Central nervous system, CNS)中数量最多的一种胶质细胞。最初认为,星形胶质细胞可作为大脑的填充细胞,支持和保护神经元。但越来越多的研究证明星形胶质细胞还可通过调节细胞外液离子浓度、pH值、葡萄糖水平和清除神经递质等活动参与神经元微环境稳态的维持,并且在促进突触形成、维护突触正常功能,调控神经元信息,调节脑血管紧张性,调节免疫功能及成年神经发生中均起作用。这些发现提示星形胶质细胞即使受到轻微的损伤也可能引发神经系统变性疾病。实际上,星形胶质细胞与很多神经系统变性疾病有关。因此,星形胶质细胞已经成为近年来大家关注的焦点。 星形胶质细胞在应对各种损伤时发生活化,称为反应性星形胶质细胞,表现为损伤局部星形胶质细胞增殖、胞体肥大、突起增多、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein, GFAP)表达上调,伴随这些形态学的变化,细胞还发生一系列生理功能的改变,包括分泌各种生长因子、细胞因子和释放细胞毒性物质,如：一氧化氮(Nitric oxide, NO)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α))、白细胞介素-1β(Interlukin 1β, IL-1β)和IL-6等。活化的星形胶质细胞对神经元起保护或毒性作用,从而发挥“双刃”效应。因此,将星形胶质细胞作为治疗CNS系统疾病靶点具有挑战性,选择性地作用于星形胶质细胞,尽量减少损害是治疗神经系统疾病最理想策略。但是由于星形胶质细胞的双重角色,增加了治疗的难度。 钙是重要的胞内信使,在可兴奋细胞和非兴奋细胞的功能活动中均发挥重要作用。星形胶质细胞内Ca2+浓度增加是细胞“兴奋”的一种表现。在帕金森病(Parkinson's disease, PD)、阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease, AD)以及亨廷顿病等神经变性疾病的发生和发展过程中,钙稳态发生改变。钙稳态失衡和异常的钙信号可能是星形胶质细胞活化的一个关键因素。TRPC(Canonical transient receptor potential, TRPC)通道是一类非选择性钙离子通道,能够感受细胞内外的多种刺激。TRPC通道包括7个亚族,即TRPC 1-7。近年来的研究表明,TRPC通道作为一类新发现的Ca2+通道,在调节胞内Ca2+平衡、传递胞外信号方面发挥重要作用。星形胶质细胞上有TRPC 1-7基因表达,其中TRPC1和TRPC3表达水平较高。研究证实,TRPC3参与多种疾病的病理生理过程,但是否参与CNS疾病过程中星形胶质细胞的活化,目前尚未见报道。 脂多糖(liposaccharide, LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分,LPS主要与TLR4 (Toll-like receptor 4, TLR4)结合,引起CNS炎症反应。本课题在上述理论的基础上,应用LPS建立体外星形胶质细胞活化模型,通过荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光细胞化学技术检测TRPC3在星形胶质细胞上表达的变化,应用共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度变化。同时通过药理学方法阻断TRPC通道的活性,观察细胞增殖、GFAP表达、IL-6分泌及[Ca2+]i变化,进一步阐明TRPC3在星形胶质细胞活化中的作用,为研究神经系统炎症性疾病的发病机制和治疗提供新的理论依据。 首先,我们观察LPS对培养星形胶质细胞增殖的影响。我们分别观察了不同剂量LPS和LPS作用不同时间后的效果。依据参考文献,我们观察0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml不同浓度的LPS作用48 h细胞增殖情况。MTS和BrdU实验结果显示,星形胶质细胞增殖随LPS浓度的增加而增加,与对照组相比,细胞活性分别增加了32.00%、44.69%、48.17%、58.45%和55.20%(p0.01),而BrdU阳性细胞百分比分别增加了33.88%、37.71%、49.10%、53.66%和39.62%(p0.01)。由此可见,LPS呈剂量依赖性促进星形胶质细胞增殖。我们选择0.5μg/ml LPS来观察LPS作用不同时间后对星形胶质细胞活性的影响。0.5μ/ml LPS作用24 h和48 h后,星形胶质细胞活性分别为146.37%和155.36%,而不加LPS的细胞正常培养24 h和48 h后,其活性分别为119%和124.08%,LPS作用24 h和48 h均能显著增加细胞活性(p0.05)。因此,后续细胞增殖实验选用0.5μg/ml LPS作用48 h。 GFAP是星形胶质细胞的骨架蛋白,被公认为是星形胶质细胞活化的特征性标记物,在病理状态下出现反应性上调,其上调机制尚未完全阐明。接下来我们通过观察0.5μg/ml LPS分别作用2 h、6h、12h、24 h、48 h后星形胶质细胞GFAP的表达情况来了解细胞活化的情况。Western blot实验结果显示,0.5ug/ml LPS作用2h后,GFAP表达显著增加,LPS作用2-48 h后星形胶质细胞中GFAP的表达分别为对照组的2.16倍、2.03倍、2.36倍、2.31倍、2.30倍(p0.01)。免疫荧光细胞化学实验结果显示,LPS作用星形胶质细胞2h后胞浆GFAP荧光明显增强,一直持续到48 h,进一步证实LPS可诱导GFAP表达。 IL-6为大家熟悉的免疫炎性因子,为检测星形胶质细胞活化后是否通过释放IL-6参与炎症反应,我们检测了LPS对星形胶质细胞中IL-6变化的影响。实验结果显示,生理情况下,IL-6分泌量很低,为1.90 pg/ml.LPS作用2h后即升高到32.02 pg/ml(p0.01),并随实验时间延长分泌持续升高,LPS作用48 h后升高到242.58 pg/ml.提示LPS能够促进炎性细胞因r IL-6的分泌。 以上实验证明致炎因子LPS可引起星形胶质细胞活化,表现为星形胶质细胞增殖、GFAP表达上调及IL-6的分泌增加。 由于TRPC通道是非选择性阳离子通道,能够介导胞外Ca2+内流,使细胞内钙离子浓度(Intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)升高,而[Ca2+]i升高是星形胶质细胞兴奋的标志。我们接下来观察LPS对星形胶质细胞TRPC3的影响。用荧光定量PCR.Western blot和免疫荧光细胞化学技术检测LPS对TRPC3表达的影响,结果发现0.5 ug/ml LPS处理2 h后,TRPC3 mRNA和蛋白表达水平即升高,一直持续到48 h。LPS处理2-48 h后,TRPC3 mRNA表达水平分别为对照组的3.47倍、6.2倍、6.24倍、7.44倍和3.33倍,蛋白表达水平分别为对照组的1.84倍、2.25倍、2.32倍、2.45倍和1.91倍。免疫荧光实验显示,正常星形胶质细胞胞浆和核内均有TRPC3表达,核内表达水平较高,而LPS诱导胞浆和核内TRPC3表达增强。这提示TRPC3可能参与了LPS诱导的星形胶质细胞活化。 为验证TRPC3是否参与LPS诱导的星形胶质细胞活化反应,我们利用2-APB和SKF96365两种TRPC通道阻断剂来观察LPS对星形胶质细胞增殖、GFAP表达和IL-6分泌的影响。MTS和BrdU结果显示,2-APB和SKF96365呈剂量依赖性抑制LPS诱导的星形胶质细胞增殖。与LPS组相比,不同浓度2-APB组细胞活性分别降低到128.77%、127.92%、114.01%、111.78%和107.60%,BrdU阳性细胞百分比降低到152.07%、140.45%、129.22%、119.42%、107.48：而不同浓度SKF96365组细胞活性分别降低到139.26%、127.08%、126.82%、122.56%和116.83%, BrdU阳性细胞百分比降低到127.42%、127.90%、126.32%、122.12%和108.09%。流式细胞仪检测进一步显示,LPS能诱导G0／G1期细胞进入S期和M期,而10μM 2-APB和5μM SKF96365使细胞停滞在G0／G1期(p0.01),从而抑制LPS诱导的细胞增殖。同样,我们观察了2-APB和SKF96365两种TRPC通道阻断剂处理后对星形胶质细胞特异性标记蛋白GFAP表达的影响。结果显示,10μM 2-APB可以使GFAP的表达由LPS组的2.50倍降低到1.58倍(p0.01),而5μM SKF96365可以使GFAP的表达由LPS组的3.17倍降低到1.97倍(p0.05)。提示2-APB和SKF96365通过抑制TRPC通道的作用从而阻断LPS引起的星形胶质细胞GFAP表达。MTS实验和DAPI染色显示,2-APB (10μM)和SKF96365 (5μM)对正常培养的星形胶质细胞没有毒性,也不影响GFAP的表达。此外,2-APB和SKF96365可以影响IL-6的分泌水平,其中2-APB可使IL-6分泌水平由LPS诱导后的362.05 pg/ml降低到142.73 pg/ml (p0.01), SKF96365可以使其降低到224.34 pg/ml (p0.05).提示抑制TRPC通道的作用可以阻断LPS引起的星形胶质细胞IL-6的分泌。 由于TRPC通道与[Ca2+]i变化关系密切,我们首先观察LPS急性作用后,星形胶质细胞[Ca2+]i的变化,用相对荧光强度表示。结果显示,灌流液存在1.3mM Ca2+时,5μg/ml LPS引起瞬时[Ca2+]i升高并维持在较高水平,而在无钙灌流液中,LPS仅诱导瞬时[Ca2+]i升高,表明LPS诱导的瞬时[Ca2+]i升高是由细胞内钙释放引起,而随后出现的持续[Ca2+]i升高是由胞外钙内流所致。100μM2-APB既可抑制胞内钙释放,也可以抑制胞外的钙内流,而100μM SKF96365只能抑制胞外钙内流。上述结果提示LPS诱导的胞外钙内流可能与TRPC通道有关。 综上所述,LPS能促进星形胶质细胞增殖、GFAP表达和炎症因了IL-6释放,促进[Ca2+]i升高,TRPC3表达上调。TRPC通道阻断剂2-APB和SKF96365可抑制LPS诱导的持续[Ca2+]i升高,并抑制LPS对星形胶质细胞的活化作用。因此,我们推测致炎因了引起星形胶质细胞活化的机制可能与TRPC3表达上调,钙离子内流增加有关,提示TRPC3可能在与星形胶质细胞活化相关的CNS炎症性疾病中起重要作用。
【图文】：

1.星形胶质细胞的培养及鉴定分离的大鼠皮质星形胶质细胞在种植展。培养3一4d后，细胞数量增多Zh后大多数均己贴壁，部分细胞开胞体明显增大，有的细胞突起逐渐伸。至第10d，细胞长满培养瓶壁，倒置相差显微镜下见细胞分为两层，星形质细胞作为底层，其他细胞则生长在星形胶质细胞层之上(图IA)，提示原培养细胞以星形胶质细胞为主，并含有小胶质细胞、神经元和少量的寡突胶细胞。经摇床筛选纯化后观察到星形胶质细胞呈片聚集性生长，形成胶质网，未见细胞分层现象(图IB)。第2代细胞使用特异性G队P抗体进行荧光细免疫鉴定呈阳性，结果显示GFAP表达主要位于胞浆和突起内，胞核呈空泡，不显色。荧光阳性细胞统计在99%以上(图2)，，可见培养纯化的星形胶细胞阳性率已达实验要求。

图2.第二代培养星形胶质细胞纯度鉴定。A:红色荧光为星形胶质细胞特异性标记物G队P，B:蓝色荧光为非特异性细胞核标记(DAPI)染色，C为同一视野两种标记物相复合图。Fig2.IdentificationofPurityinastroeyteeulture.A:redfluoresceneerePresentsastroeytemarker(GFAP);B:bluefluoreseeneerePresentsnon一sPecifienuelear(DAPI):C:thePicturerePresentsamergebetweenGFAPandDAPI.40x.
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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1 史娟,李继硕;TRP离子通道[J];神经解剖学杂志;2004年02期

2 高艳琴,高慧,周正怡,陆世铎,孙凤艳;大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后纹状体和海马区瞬时受体电位通道蛋白4的表达增加[J];生理学报;2004年02期

本文编号：2555045