GST-LRF融合蛋白纯化及单克隆抗体的制备

发布时间：2019-11-10 19:30

【摘要】： Luman募集因子(Luman-recruiting factor,LRF)是碱性亮氨酸拉链蛋白转录因子,是Luman活化过程中必需的辅助因子,募集Luman进入特定的亚核区,促进有活性的转录复合物的形成。目前,对于LRF的生理功能尚不清楚,获得其单克隆抗体对于研究LRF的生理功能有非常重要的意义。 本研究测定分析了GST-LRF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表达的条件,以纯化的目的蛋白作为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体并进行鉴定。获得以下结果: 1 GST-LRF融合蛋白(glutathione S-transferase,GST)在E.coli BL21(DE3)中高效表达的条件为:37℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h。电洗脱法纯化得到了高纯度的目的蛋白。 2确定了检测抗GST-LRF融合蛋白抗体的间接ELISA的最佳作用条件:辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (酶标二抗)的工作浓度为1:1 200;包被抗原为10μg/mL;包被液为pH 9.6,0.05 M碳酸盐缓冲液;包被条件选择37℃作用2 h或4℃过夜;封闭液为1.0%明胶,封闭条件为37℃作用1 h。 3用间接ELISA筛选阳性孔,通过有限稀释法筛选出3株分泌抗GST-LRF单克隆抗体的杂交瘤细胞株:A2E4、B2G6、D2F5。 4采用腹水诱生法制备了A2E4、B2G6、D2F5 3株杂交瘤细胞的单克隆抗体,间接ELISA测定腹水抗体效价均为1:10 000,交叉性试验表明制备的单抗具有特异性,ELISA测定抗体的相对亲和力分别为:0.773μg/mL、0.800μg/mL和0.355μg/mL。
【图文】：

2.2.2 诱导剂浓度对蛋白表达的影响在不同浓度诱导剂 IPTG 0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L，，其他条件不变的条件下进行诱导表达，SDS-PAGE 分析（见图 2-2）；

重组蛋白可溶性分析融合蛋白可溶性分析结果表明，重组质粒转化菌经裂解处理后，裂解液上清没有蛋白条带，而在沉淀中则出现了明显的蛋白条带（图 2-4），提示表达的目的蛋要以包涵体的形式存在于表达产物。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.6

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本文编号：2559003