自身免疫调节因子对大分子自噬及细胞吞噬功能的影响

发布时间：2019-11-21 18:49

【摘要】： 第一部分自身免疫调节因子与大分子自噬 目的 自身免疫调节因子(AIRE)具有诱导中枢免疫耐受的潜能,但在外周免疫耐受中,其功能未明。考虑大分子自噬可参与免疫耐受的诱导,我们初步探讨了自身免疫调节因子在外周中的表达及其对外周单核细胞系THP-1大分子自噬的影响。 方法 真核表达载体pEGFP-AIRE经双限制性酶切、PCR扩增及DNA测序分析鉴定；依据密度梯度离心与贴壁培养法进行外周血单个核细胞及单核细胞的分离；THP-1细胞由佛波醇酯诱导分化后通过瑞氏-姬姆萨染色进行形态学鉴定；细胞转染按脂质体法进行；AIRE表达抑制采用siRNA的方法；荧光显微镜观察GFP-AIRE融合蛋白的表达和亚细胞定位；转染效率经RT-PCR与Western Blot进行验证；自噬小体在胞内的形成和定位通过间接免疫荧光染色指示；大分子自噬的抑制采用PI3K抑制剂(渥曼青霉素)进行诱导；LC3B-Ⅱ与p62/SQSTM1的蛋白表达变化经Western Blot进行检测。 结果 质粒DNA经双酶切、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后可见特异性条带；DNA测序结果显示测定序列与AIRE (NM_000383.2)基因序列符合率99%(BLAST评分1698)。外周血单个核细胞、单核细胞、U937和THP-1细胞存在AIRE mRNA表达；单核细胞和THP-1细胞仅表达低水平AIRE蛋白。诱导后,THP-1细胞呈贴壁生长,胞体增大,形态多样性,核不规则,胞浆内空泡,吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态。质粒转染48小时后,荧光显微镜显示GFP-AIRE融合蛋白以斑点状定位于细胞核内；在mRNA和蛋白水平,AIRE均呈明显高表达；而AIRE siRNA则明显抑制GFP-AIRE融合蛋白及AIRE mRNA与蛋白的表达。过表达AIRE可上调LC3B-Ⅱ的表达和自噬小体的形成；而大分子自噬抑制剂与AIRE siRNA可抑制AIRE介导的上调效应。过表达AIRE或大分子自噬抑制剂与AIRE siRNA对p62/SQSTM1蛋白表达无影响。 结论 真核表达载体pEGFP-AIRE构建正确,可应用于体外转染研究。AIRE可表达于外周单核细胞并通过上调LC3B-Ⅱ的表达和自噬小体的形成促进单核细胞大分子自噬。AIRE介导单核细胞大分子自噬的信号转导通路可能与p62/SQSTM1蛋白无关。通过促进单核细胞大分子自噬,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。 第二部分自身免疫调节因子与凋亡细胞的吞噬清除 目的 凋亡细胞是自身抗原成分的主要来源之一,适时清除凋亡细胞对维持免疫自稳具有重要意义。作为细胞死亡的两种不同形式——大分子自噬与凋亡共享许多调节因子,基于本文第一部分研究结果,为继续探讨自身免疫调节因子(AIRE)在外周免疫耐受中的功能,我们在非“职业”吞噬细胞——上皮细胞系16HBE中探讨了AIRE对吞噬凋亡细胞的影响。 方法 16HBE细胞的转染使用来源于第一部分研究的真核表达载体pEGFP-AIRE通过FuGENEHD转染法进行；转染效率经荧光显微镜、RT-PCR与Western Blot进行验证；HL-60细胞的凋亡由喜树碱诱导后通过Annexin V-FITC/碘化丙啶双染色进行流式细胞仪检测：吞噬凋亡细胞的检测通过髓过氧化物酶(MPO)染色进行显示；吞噬相关基因(Rac 1)的表达变化经RT-PCR与Western Blot进行检测。 结果 pEGFP-AIRE转染48小时后,荧光显微镜显示GFP-AIRE融合蛋白以斑点状定位于16HBE细胞核内；通过RT-PCR与Western Blot检测,AIRE mRNA和蛋白均呈明显高表达。对比未经凋亡诱导的阴性对照组,流式细胞仪检测显示,喜树碱诱导的HL-60细胞凋亡率上升约3倍[(4.08±0.26)%Vs(13.46±1.71)%]。在与凋亡细胞共孵育1小时后,可见转AIRE基因16HBE细胞吞噬率为(25.5±3.67)%,而转染空载体16HBE细胞吞噬率为(6.25±1.58)%,两者间具有显著性差异(P0.05)；但过表达AIRE对16HBE细胞吞噬未凋亡细胞无明显影响[(1.0±0.67)%]。同时,过表达AIRE可上调16HBE细胞Rac 1 mRNA和蛋白表达。 结论 16HBE细胞对凋亡细胞具有基础吞噬率,可作为体外研究吞噬凋亡细胞的细胞模型。MPO染色法对检测吞噬来源于MPO阳性靶细胞的吞噬效应具有较好对比度,可作为体外显示吞噬效应的检测方法。AIRE可促进上皮细胞对凋亡细胞的吞噬,通过上调Rac1的表达促进对凋亡细胞吞噬清除防止“自我”抗原“暴露”,AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。
【图文】：

序是鉴定载体中目的基因的理想方法。如图l所示，经EcoRI与Sall双琼脂糖凝胶电泳后可见环状的质粒DNA被酶切为含目的基因(A工RE，1638体序列(3062bp)的两条特异性条带，而未被酶切的完整质粒DNA则显示和开环两种形式的条带，其中超螺旋状态的质粒(即位于下方的条带)含量丰，以针对AIRE设计的特异性引物、纯化的质粒DNA为模板的PCR扩增反应，RE的特异性PCR扩增产物(250bp)(图2)。质粒DNA的测序结果经BLA比对后，显示测定序列(评分1698)与AIRE(NM--000383.2)基因序列的符%。因此，，通过双限制性核酸内切酶酶切、特异性引物PCR扩增和质粒DNA明了载体的构建正确。

螺旋和开环两种形式的条带，其中超螺旋状态的质粒(即位于下方的条带)含量丰富。同时，以针对AIRE设计的特异性引物、纯化的质粒DNA为模板的PCR扩增反应，可见AIRE的特异性PCR扩增产物 (250bp)(图2)。质粒DNA的测序结果经BLAST数据库比对后，显示测定序列(评分1698)与AIRE(NM--000383.2)基因序列的符合率为99%。因此，通过双限制性核酸内切酶酶切、特异性引物PCR扩增和质粒DNA的测序证明了载体的构建正确。AIR尼(，63公卜P)图1质粒ONA的双酶切 M:DNAMarkerl，3，5:PEGFP·AIREZ，4，6:AIRE24
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：2564125