新型B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗的研制及其防治大鼠类风湿关节炎的疗效与机理研究

发布时间：2019-11-22 01:14

【摘要】： 有关RA治疗策略的探索始终是国内外尤为关注的焦点、热点和难点。由于迄今对于RA的病因认识不清,对其病机了解不深,目前尚无任何特异性根治疗法。所使用的药物与方案也就是非特异性缓解对症疗法,都必然会产生多种多样的严重毒副作用。因此,如何能发现或发明理想、高效、低毒、特异的药物,使其既能迅速缓解RA的表症,而且更能有效地针对其病机,选择性地阻断其病理生理过程的全新型制剂已是风湿学领域亟待解决的关键首要问题!业已证明,RA是一种抗原驱动由CD4+CD28+Th1细胞介导的全身性自身免疫病。鉴于RA病人的滑膜炎症和关节破坏变形与免疫功能的改变密切相关,近年来国外趋向于将对免疫调节作用的药物作为治疗RA的第一线药,并对RA新的免疫治疗策略进行了广泛的研究。“基因或DNA治疗性疫苗”就是其中最受重视和最为推崇的一种,它是自二十世纪九十年代国际上兴起治疗自身免疫病的特异性免疫疗法之一,也是近年来免疫学研究领域中最活跃、最富有成效的领域之一。 从理论上讲,任何能够有效减少、抑制或阻断RA病理生理发生与发展进程的药物都能有效减轻或缓解RA的骨关节病变。鉴于B7:CD28/CTLA4共刺激信号途径在其发生发展的病理生理过程中发挥重要作用这一事实,选择性阻断B7:CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受已成为有效防治自身免疫性疾病的重要策略之一。其中最具代表性的突破则是完全人源化新型重组融合蛋白CTLA4-Ig的研发成功,它能选择性阻断B7:CD28/CTLA4系统并在防治RA的动物实验尤其是临床研究中取得显著疗效。2005年12月美国FDA在国际上首次正式批准CTLA4-Ig作为一线药临床应用于中至重度RA的治疗。从而为这一策略的更深入研究尤其是RA的临床应用奠定了坚实的基础。然而,纵观目前国际上探索B7:CD28/CTLA-4系统诱导免疫耐受防治RA的研究手段,采用的均是以CTLA4-Ig或抗B7单抗/多抗来进行封闭或阻断。其缺陷在于:第一,无论是抗CTLA4-Ig或B7单抗/多抗的封闭或阻断,均不能诱导长期免疫耐受;第二,仅仅封闭B7:CD28/ CTLA-4系统所诱导的T细胞免疫耐受可被感染等因素所引起释放的IL-2及其它细胞因子所逆转,导致治疗无效或失败;第三,仍存在其它的共刺激信号途径可以补偿CD28信号的缺失,而旁路激活CD28+T细胞。针对上述缺陷,本课题拟将免疫耐受与基因治疗性疫苗两大策略充分进行有机结合创新性研制全新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,并系统观察了该新型疫苗对CIA防治的疗效,探讨了其相关作用机制,获得如下研究结果: 勿庸置疑,本研究的关键是能否成功构建在真核细胞中高效表达的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗。为此,本课题首先以原核表达载体pRSETA/B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/B7-2-PE40。在基因测序证实B7-2-PE40真核表达载体构建成功的基础上,采用脂质体转染的方法将B7-2-PE40真核表达载体转染入CHO-K1-RPE.40细胞,经ZeocinTM筛选获得稳定转染细胞株后,利用RT-PCR、Western Blot及ELISA的方法分别从mRNA和蛋白水平检测了B7-2-PE40在CHO-K1-RPE.40真核细胞中的表达情况。检测结果显示,转染入真核细胞的pcDNA3.1/ B7-2-PE40质粒经历转录、翻译及翻译后修饰被分泌至胞外,相对分子质量约为90kDa,平均106个转染细胞24h表达0.23μg/L。将稳定转染细胞与CD28高表达细胞系人淋巴瘤细胞系Jurkat和CD28低表达的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji共孵育,采用MTT法对其特异性杀伤活性进行了测定。活性测定显示,真核载体所表达的B7-2-PE40能特异性杀伤高表达CD28的Jurkat细胞,而对低表达CD28的Raji细胞抑制率甚低。由此证明本课题构建的pcDNA3.1/B7-2-PE40真核表达载体可在真核细胞中高效表达,且表达产物具有很好的靶向免疫抑制活性。 在此基础上,我们选择了肌肉注射结合电脉冲刺激的方法,将150μg pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗注入CIA大鼠体内,利用RT-PCR和流式细胞计数的方法检测了B7-2-PE40在活体内的表达情况及生物学活性。结果显示pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒进入机体2天即可检测出mRNA,14天达到高峰,而后逐渐减弱,至第56天基本检测不到。其真核表达产物B7-2-PE40可发挥特异性细胞杀伤活性,在pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒肌肉注射第2d时,CIA大鼠体内CD28+T细胞已被明显杀伤。第4天时,CD28+T细胞下降至最低,达34%。此后有短暂恢复。随着B7-2-PE40在14天表达高峰的到来,在第21天时再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表达的降低,CD28+ T细胞所占比例逐渐增加,并于第56天时恢复至正常水平。ELISA检测结果表明,pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒表达产物作为异源蛋白在体内的的抗原性较低,基本上不产生针对PE40的抗体。上述结果表明,我们所研制的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗可在大鼠体内表达并发挥作用。 那么,这种全新型的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗所表达的产物是否具有生物学功能?尤其是在RA大鼠模型体内能否有效的防治CIA病情的发生与发展?这是我们最为关注的大问题。因此我们采用鸡Ⅱ型胶原在Wistar大鼠中建立了CIA作为RA的动物模型,造模成功率为80%。经四肢关节肿胀程度评分、放射影像学和组织病理学验证,该模型与文献报道的一致,完全符合CIA大鼠RA模型体内实验治疗的标准要求。而后我们分别观察了该新型外毒素融合基因疫苗预防和治疗CIA大鼠的效应。将不同剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗分别在诱导CIA模型的当天预防性或第12天治疗性给予CIA大鼠,综合四肢关节肿胀程度评分、组织病理学变化和抗CⅡ抗体的滴度变化来系统评价对CIA疾病进程的影响。预防各组在诱导CIA模型的第一周中均会出现微弱的关节炎症表现。随着B7-2-PE40质粒的表达,关节炎症状会逐渐消失。剂量为200μg/只的预防组在10周内均能很好地抑制关节炎的发生,减轻关节炎的严重程度,其效果优于“金标准”的MTX组。而在剂量为300μg/只的预防组中仅部分地抑制了关节炎症的发生,从第3周起,关节炎症逐渐明显。pcDNA3.1空载体预防组无任何预防效果,其临床积分类似于CIA对照组。治疗各组是在诱导CIA模型的第12天出现足爪红肿时,分别给予每只150μg、200μg和300μg剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗,结果发现在给予基因疫苗治疗的第5天后即开始发挥作用,一直延续到第10周实验结束后。200μg/只治疗组、300μg/只治疗组的疗效与标准低剂量MTX/1次/周×4周治疗组的接近,均可明显减轻四肢关节肿胀程度,降低疾病发生率;而150μg/只治疗组的关节炎症指数略高于上述三组,但明显低于pcDNA3.1空载体治疗组及CIA对照组。与CIA对照组相比,pcDNA3.1空载体组对CIA大鼠四肢关节肿胀程度无任何治疗作用,两组的临床评分基本接近。应说明的是,在300μg/只治疗组大鼠胶原注射处可见溃疡形成,且经久不愈。组织病理结果与肉眼观察相一致;pcDNA3.1空载体对照组的结果与CIA组类似。而经pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗预防及治疗后的各组均有一定程度的改善:滑膜增生减弱,炎性细胞浸润明显减少,少见纤维样物质沉积,基本看不到骨及软骨的破坏。在治疗各组中,MTX治疗组病理改变最好,其次为200μg治疗组;而在预防各组中,200μg预防组病理改善表现优于MTX预防组。300μg预防组的病理表现类似于CIA对照组,可见炎性细胞浸润,纤维增生,局部有坏死及肉芽肿形成。通过ELISA检测体内抗CⅡ抗体滴度的变化表明,与CIA对照组相比,200μg预防组和MTX组可明显降低体内抗CⅡ抗体水平(P0.05),而其他各组尽管也能降低抗CⅡ抗体水平,但无统计学差异。上述结果提示200μg/只剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗可有效防治CIA疾病的发生,缓解CIA疾病的进程。 为了探索pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗有效防治CIA大鼠的相关机制,我们系统观察了CIA大鼠注射pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗后对其免疫系统的影响。研究结果表明,该基因疫苗在体内所表达的B7-2-PE40能有效杀伤CD28+ T细胞,提高CD4+ CD25+ Treg细胞亚群及CD8+ CD28- Ts细胞亚群的比例;有效纠正CIA产生的Th1偏移,下调CD4/CD8比值,明显降低炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ的浓度(P0.05),抑制IFN-γ分泌型Th1细胞的产生,促进抗炎细胞因子IL-10及IL-4分泌型Th2细胞的生成。而对IL-2和TGF-β的影响不大,尤其是对IL-4基本没有影响。上述结果证实pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗主要是通过抑制致病性T细胞的活化,纠正T细胞亚群及细胞因子网络的失衡,抑制B细胞介导的针对胶原的体液免疫应答来有效控制并减缓CIA的发生与发展的。 总之,本研究在国际上原创性的研制成功首个新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,它能在体内有效表达具有特异靶向阻断B7:CD28共刺激信号途径的B7-2-PE40外毒素融合蛋白,经CIA大鼠模型证实该基因疫苗能有效地预防和治疗类风湿关节炎的发生与发展,并对其相关作用机制进行了探讨,为今后临床进一步研究及应用奠定了坚实基础,也为类风湿关节炎的治疗提供了更多更广的新思路和新策略。
【图文】：

抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/B7-2-PE40按图1所示构建（真核表达载体图见附录1）。用所设计的PCR引物扩增人B7-2-PE40，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小为1919bp的特异性条带（图2）。将双酶切回收后产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点，，构建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重组质粒，经质粒提取、双酶切后电泳（图3）和测序鉴定结果（图4，测序图见附录2），得到阳性克隆。测序显示信号肽之后的碱基序列没有发生点突变和移码突变，与原核表达质粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致，与人B7-2以及PE40蛋白一、二级结构比对结果见表1。

2.1 pcDNA3.1/B7-2-PE40 真核表达载体的构建为使B7-2-PE40融合基因可在真核细胞中表达，一个含有B7-2-PE40以及Zeo抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/B7-2-PE40按图1所示构建（真核表达载体图见附录1）。用所设计的PCR引物扩增人B7-2-PE40，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小为1919bp的特异性条带（图2）。将双酶切回收后产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点，构建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重组质粒，经质粒提取、双酶切后电泳（图3）和测序鉴定结果（图4，测序图见附录2），得到阳性克隆。测序显示信号肽之后的碱基序列没有发生点突变和移码突变，与原核表达质粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2564256