凝血酶促进MSC增殖、分泌纤维连接蛋白及相关机制探讨

发布时间：2020-01-30 13:10

【摘要】：间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）具有免疫调节和分泌细胞因子等功能，在细胞治疗和组织工程中具有重要的应用价值，是目前除了造血干细胞之外临床应用研究最多、最成熟的一种成体干细胞。间充质干细胞在组织中的丰度很低，要达到临床应用的数量级，就必须进行体外的扩增培养。胎牛血清常用作为细胞培养的营养和刺激物，可以实现MSC在体外的稳定增殖。然而，胎牛血清培养基培养的MSC，牛血清蛋白可被吞噬进入细胞浆，从而残留在细胞内，在临床治疗过程中可能引起患者机体免疫反应，造成血清病或其他免疫性疾病。此外，胎牛血清还具有明显的批次间差异，从而影响MSC培养的稳定性。因此，化学成份确定的无血清培养基是培养安全、稳定的临床应用级MSC的趋势。然而，由于无血清培养基中缺乏大量细胞生长因子，间充质干细胞增殖缓慢或不能增殖。更关键的是由于MSC是贴壁生长细胞，无血清培养基中缺乏各种粘附贴壁因子，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原等，从而影响MSC的贴壁。因此，需要添加大量的细胞生长因子和细胞基质蛋白包括纤维连接蛋白、胶原和胎球蛋白，以维持MSC的增殖和贴壁。事实上，MSC是一种分泌型细胞，本身具有分泌很多细胞因子、生长因子和一系列的细胞外基质包括胶原和FN的能力。所以我们设想是否可以通过某种刺激，促进MSC自身分泌细胞外基质和增殖，从而解决MSC增殖和贴壁的问题？如果可行，这将为研究间充质干细胞无血清培养基提供一条新的思路。通过文献调研和预实验的筛选，我们选择了临床药物凝血酶作为刺激物。凝血酶是丝氨酸蛋白酶家族成员，具有多种生物学功能，其不仅在凝血过程发挥作用外，还能诱导细胞发生许多生物学效应。研究发现凝血酶能够刺激肾小球基底膜细胞合成胶原和刺激人肾小球近端小管上皮细胞分泌FN，还能诱导肥大细胞更易于贴壁和促进胶质瘤细胞增殖和分泌神经生长因子等。本课题主要就凝血酶对MSC的作用及其可能的作用机制进行探讨，内容包括凝血酶对间充质干细胞分泌表达FN的作用及其作用的途径，以及凝血酶对间充质干细胞增殖及其他生物学特性的影响。首先，我们利用传统密度梯度分离和差速贴壁的方法，从健康供者骨髓中分离MSC，并经流式鉴定和诱导分化鉴定后，作为实验研究用细胞。为了观察凝血酶是否具有对MSC作用的可能性，我们通过PCR方法检测MSC是否表达凝血酶受体——蛋白酶活化受体（Protease activated receptors, PAR）。结果显示MSC表达凝血酶受体PAR1和PAR2，说明凝血酶有可能通过PAR1和PAR2对MSC发挥作用。之后，我们通过PCR、免疫荧光和ELISA等方法，在mRNA、蛋白质和细胞水平，分别检测凝血酶刺激后MSC表达FN的情况，通过1h细胞自然贴壁试验检测凝血酶刺激MSC后细胞贴壁率，PCR方法检测细胞粘附分子ITGA。结果显示，凝血酶作用后，MSC在RNA水平FN表达增高（是对照组3倍，p0.05）；分泌到细胞培养上清中的FN量明显增高（p0.01），且具有明显的时间效应和浓度依赖性。同时，MSC细胞浆中FN表达量也明显升高。经过凝血酶预处理的MSC，贴壁能力明显高于对照组（p0.01），与细胞粘附相关的因子ITGA5表达也增高。我们的结果说明，凝血酶可以促进MSC表达和分泌FN，并提高MSC贴壁能力。为了进一步研究凝血酶促进MSC分泌FN的机制，通过WESTERNBLOTTING方法检测凝血酶作用后信号通路激活情况。结果显示，凝血酶作用后，ERK1/2信号通路发生快速磷酸化，在5min就达到峰值，并且至少持续60min。同时，凝血酶还诱导NFKB信号通路发生磷酸化，然而与ERK1/2信号通路不同的是，NFKB p65在60min才达到磷酸化的最高值。为了进一步研究哪一条信号通路在凝血酶刺激FN分泌中起主要的作用，我们用NFKB、EKR信号通路特异性抑制剂丙酮酸酯（EP）和PD98059分别阻断NFKB和ERK的活化，然后用ELISA检测MSC分泌FN情况。结果显示，当NFKB和ERK被阻断后，FN分泌均下降，尤其以ERK通路被阻断后，抑制效果更明显（p0.01）。而NFKB通路被阻断后，虽然FN的分泌受到了明显的抑制，但是，培养上清中FN的浓度仍然明显高于无血清对照组（p0.05）。为进一步观察凝血酶是通过哪个受体激活NFKB和ERK通路，我们用PAR1和PAR2受体特异性抑制剂SCH79797和FSLLRY-NH2，分别阻断PAR1和PAR2受体，观察凝血酶处理后MSC信号通路以及分泌FN的变化。结果显示，PAR1受体被阻断后，ERK信号通路快速磷酸化（5min）不受影响，但是其持续磷酸化作用被抑制，，FN分泌量较凝血酶单独刺激对照组降低（p0.05），但仍然高于无血清对照组（p0.05）；而PAR2受体被抑制后，ERK信号通路被明显抑制，同时FN分泌量被明显抑制（p0.01），与无血清对照组相比无明显差异。结果还显示，PAR受体抑制剂对NFKB信号通路磷酸化影响不大。由此推测，凝血酶可能通过PAR受体激活ERK通路促进FN的分泌表达，同时还可能通过其它间接通路激活NFKB信号通路，影响FN的分泌表达。此外，我们通过MTT方法和CFSE标记MSC流式细胞术的方法，观察了凝血酶对MSC增殖的影响，分析了经凝血酶刺激培养的MSC，其细胞表面标志物CD31, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105和HLA-DR的表达，和α-tubulin免疫荧光方法分析MSC的细胞骨架结构情况，以及MSC的体外分化能力和免疫调节功能的变化。MTT结果显示，凝血酶可显著刺激MSC增殖，效应呈浓度依赖性；当凝血酶浓度为0.5U/ml时，细胞增殖明显提高(p0.05)，浓度为8U/ml时，刺激活性达峰值（p0.01）。流式结果显示，凝血酶作用后MSC增殖代数明显增加，增殖指数较对照组增高（P0.01），验证了凝血酶具有促进MSC增殖的作用。而经凝血酶刺激培养的MSC细胞表面标志物、细胞骨架没有发生明显改变，并且依然保持诱导分化成骨细胞、脂肪细胞的能力和抑制异体淋巴细胞增殖转化能力。为了研究凝血酶促进MSC增殖的机制，探讨PAR受体在凝血酶促进MSC增殖中的作用，我们使用PAR受体特异性抑制剂SCH79797和FSLLRY-NH2分别阻断PAR1和PAR2受体，观察凝血酶对MSC增殖作用的影响。结果发现，当PAR1受体被阻断后，凝血酶促进MSC增殖的作用被抑制（p0.05）；当PAR2受体被抑制后，凝血酶促MSC增殖作用不受明显影响。凝血酶作用后，AKT信号通路被激活，而当AKT信号通路被抑制后，细胞增殖也被完全抑制。此外，凝血酶还能通过PAR1受体激活ERK1/2信号通路，通过特异性抑制剂证实，ERK1/2信号通路也与凝血酶促进MSC增殖作用有关。PCR方法检测细胞增殖相关的基因表达发现，凝血酶作用后与调控细胞增殖相关的c-MYC、EGR1基因表达上调，并分别被AKT信号通路抑制剂和ERK1/2信号通路抑制剂抑制。由此推断，在无血清培养基中添加凝血酶，可以通过PAR1受体激活AKT信号通路，上调c-MYC基因表达；通过PAR1受体激活ERK1/2信号通路，上调EGR1基因表达，促进MSC增殖。上述研究结果可以得出如下结论：（1）凝血酶可以通过PAR受体介导的ERK1/2信号通路磷酸化，促进MSC自身FN的表达和分泌，并且间接激活的NFKB信号通路也参与了促进MSC表达和分泌FN的过程；（2）凝血酶可促进MSC在无血清培养基中的贴壁能力和粘附分子ITGA5的表达；（3）凝血酶可通过MSC表面PAR1受体，激活AKT和ERK1/2信号通路，上调c-MYC、EGR1基因的表达，促进MSC的增殖。研究也表明，经凝血酶刺激的MSC仍然保持其原有的生物学特性，具有分化成骨细胞、脂肪细胞和免疫抑制能力。以上结果为研究适用于临床级MSC培养的无血清体系，提供了一种新的策略。当然，新培养体系进入临床应用前，仍需要进行更深入的研究，以探讨新体系所培养细胞的安全性和稳定性等。
【图文】：

形态图,骨髓,形态

数据采用 SPSS13.0 或 GraphPad Prism 6 进行统计处理。定量资料以X±SD 表示。实验组间采用单因素方差分析(ANOVO)，方差齐性且具有统计学意义时，采用 Dunnett's 多重比较检验方法对组间进行分析，p<0.05 认为具有明显的统计学差异。结果3. 结果3.1 骨髓 MSC 分离培养结果骨髓一直是 MSC 的主要来源之一，大约每万分之一到百万分之一个骨髓单个核细胞中含有一个原始 MSC，我们采用经典的梯度密度离心和差速贴壁的方法成功的分离 MSC 并扩增培养。光学显微镜下观察，培养第 3 天可见少量贴壁的纺锤形细胞和其他血细胞（图 1-1A），第 7-10 天可见细胞呈集落样生长（图 1-1B），第 12-14 天可见集落呈较大的成纤维样、鱼群状生长（图 1-1C）。经消化传代后，获得均一的细胞。（见图 1-1D）A B

表面标志,骨髓,连接蛋白

硕士论文第一部分：凝血酶促进 MSC 分泌纤维连接蛋白及机制3.2 骨髓 MSC 流式鉴定结果根据国际细胞治疗协会关于 MSC 鉴定的标准，我们对获得的 MSC 进行流式细胞分析表面标志物表达情况。结果显示，获得的细胞高表达 CD44, CD73, CD90,CD105, 不表达 CD34, CD45, CD31 和 HLA-DR （见图 1-2），符合 MSC 的表达标准。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

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