噬菌体库筛选猕猴神经干细胞表面标记物

发布时间：2020-02-24 10:08

【摘要】：寻找胚胎干细胞以及胚胎干细胞分化得到的细胞系的特异性标志物一直是干细胞研究领域的热点问题。由于干细胞保持自我更新和分化的信号通路尚未完全阐明,体内分化过程无法在体外培养模型中重现,专一的针对胚胎干细胞及其分化细胞系标志物的缺乏,影响了干细胞及其分化细胞系在临床中的应用。 本研究通过培养并定向诱导猕猴胚胎干细胞,利用检测胚胎干细胞关键基因OCT4,Nanog,SOX2的表达情况以及碱性磷酸酶(AKP)的检测来鉴定胚胎干细胞的培养状态;并用悬浮培养和RA+B27诱导的方法来定向诱导猕猴胚胎干细胞使其向神经干细胞方向分化。利用免疫荧光检测和RT-PCR检测神经干细胞关键基因Nestin, SOX2, Mushashi-1的表达来鉴定神经干细胞。并通过用差异酶处理法获得相对比较纯的神经干细胞。 利用噬菌体展示库PH.D-12,以及全细胞悬浮筛选的方法,采用反向/正向的筛选策略,我们获得猕猴胚胎干细胞诱导得到的神经干细胞的特异性多肽。通过四轮的筛选,5个特异的肽段被筛选出来。其中HGE多肽是通过全细胞EILISA检测选择的最适合与神经干细胞结合的肽段。为进一步分析所选多肽与神经干细胞的结合,免疫细胞化学ICC以及免疫荧光检测用于标记和检测展示HGE肽段的噬菌体与细胞表面的结合。鉴于检测的灵敏度,我们利用新型的荧光材料,量子点标记技术与合成的肽段联结。 而另一个与猕猴神经干细胞有很强结合能力的多肽APW,与猕猴胚胎干细胞同样有很强的结合能力。因此,着重对APW进行了生物信息学分析和毒性初步分析。通过MTT实验,PI/Hoechst 33342双染流式细胞术,细胞周期实验,APW对猕猴胚胎干细胞没有明显的细胞毒性。生物信息学分析表明,APW与人类的hCG2045796相似度较高。通过预测APW三维结构和与猕猴胚胎干细胞的结合方式和结合位点,为进一步研究APW的特异性和亲和力提供了研究方向。 本研究为将来的神经干细胞标记,分离,纯化,以及信号通路的研究提供了研究基础。研究中所采用的方法,同样适用于研究其它的特殊种类的细胞。
【图文】：

利用悬浮培养及RA诱导获得神经干细胞

猕猴胚胎干细A，传代到小鼠PMEF上的猕猴ESc；B，，传传代5天的ESc；E
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【共引文献】

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本文编号：2582401