Pokemon在HepG2细胞中对CDK2基因表达的调控作用

发布时间：2020-02-25 01:31

【摘要】： 目的: 研究原癌基因pokemon在HepG2细胞中对细胞周期蛋白依耐性激酶CDK2基因表达的调控作用。 方法: 1.构建不同长度的CDK2启动子荧光素酶报告基因载体,分别转染到HepG-2中,通过双荧光素酶报告基因检测法检测pokemon对CDK2启动子活性的影响。 2.染色质免疫共沉淀技术检测细胞内pokemon蛋白与CDK2启动子相互作用的关系。 3.点突变技术确定pokemon与CDK2启动子结合的可能位点。 4.Real-Time PCR技术检测pokemon对CDK2 mRNA表达的影响。 5.Westernblot技术检测pokemon对CDK2蛋白表达的影响。 结果: 1.双荧光素酶报告基因显示: CDK2基因ATG上游528bp为CDK2启动子的核心活性区域,pokemon在HepG2细胞抑制了CDK2启动子活性。 2.染色质免疫共沉淀技术显示:细胞内pokemon可通过直接结合CDK2启动子来调控CDK2的表达。 3.点突变技术显示:-259 bp至-249bp可能是pokemon与CDK2启动子结合的序列。 4. RealTime-PCR显示: pokemon可下调HepG2细胞中CDK2 mRNA表达水平。 5.Westernblot显示:pokemon可降低HepG2细胞中CDK2蛋白表达水平。 结论: 1.在HepG2细胞内pokemon可通过直接与CDK2启动子的结合调控CDK2启动子活性, -259 bp至-249bp可能是pokemon在CDK2启动子上的重要调控元件; 2.在肝癌细胞HpG2中pokemon可下调CDK2 mRNA水平,可降低CDK2蛋白表达。
【图文】：

结 果启动子重组载体的构建pG2 细胞基因组 DNA 为模板，，扩增出不同片段长度 CDK2 启动结果如图 1、2，经过酶切连接转化电泳鉴定得到重组子如图 3、的 2 号、5 号及图 4 的 1、2 号均经上海英俊生物技术有限公司 CDK2-528、CDK2-1046 重组子。图 3 示酶切后在 4242bp 和 5两条带，分别代表载体与 CDK2-528bpDNA 片段。而如图 4 在 附近也显示两条带，分别代表载体与 CDK2-1046DNA 片段。M80150M

的 2 号、5 号及图 4 的 1、2 号均经上海英俊生物技术有限公司测序 CDK2-528、CDK2-1046 重组子。图 3 示酶切后在 4242bp 和 528b两条带，分别代表载体与 CDK2-528bpDNA 片段。而如图 4 在 424p 附近也显示两条带，分别代表载体与 CDK2-1046DNA 片段。M2-528PCR 产物电泳图； 图 2 :CDK2-1046 PCR 产物电泳图0bp00bp50bp00bp50bp00bp8000bp2500bp8000bp5000bp15000bp500bp1000bM 1 2 3 4 5MM 1 215000bp528bp1046bp
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

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本文编号：2582589