端粒酶和脑源性神经生长因子共修饰骨髓间充质干细胞的实验研究

发布时间：2020-02-26 08:28

【摘要】： 颅脑创伤(traumatic brain injury, TBI)是一种致死率和致残率都很高的疾病,给人类个体、家庭乃至整个社会都带来了许多的负担。对于颅脑创伤的治疗,人们一直致力于对损伤脑组织保护的研究,以减轻原发性和继发性脑损伤。 利用干细胞治疗中枢神经系统损伤,是目前学术界广泛关注的神经损伤治疗新策略,它为颅脑创伤后的神经修复治疗带来了新的曙光。目前研究的重点为调控干细胞治疗的安全性和有效性。近年来,研究人员发现骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)是一种优秀的载体细胞,它取自自体骨髓,取材方便,且体外易培养,增殖快。并且由于来源于自体,BMSCs免疫原性较弱,能够抑制混合淋巴细胞反应,由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题,亦不涉及伦理道德问题,因此通过体外培养扩增后的BMSCs是组织工程中理想的种子细胞。它在体内或体外诱导条件下可以向神经元方向转化,也可以分泌神经生长因子,如神经生长因子(neural growth factor, NGF)、脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)等,从而发挥对损伤神经组织的修复作用。但BMSC也会因其生存周期短且不稳定而影响其发挥神经保护功能。 本研究通过比较,筛选出脑创伤修复相关基因脑源性神经生长因子(BDNF)；进一步通过转染阳离子脂质体介导的外源性端粒酶表达,使BMSC永生化,获得了hTERT调控的的永生化大鼠BMSC,避免细胞过早衰老,稳定其在体内外的生长。我们进一步构建BDNF高效表达载体,并转染Ad5-BDNF至hTERT-BMSC,证明了转染BDNF的永生化BMSC在体外通过高表达BDNF具有一定的损伤细胞修复作用。在此基础上,还借助大鼠TBI模型和立体定向技术研究TBI组织内该细胞系统的生物学特征与转归,证明了其在大鼠体内的安全性和对TBI治疗的有效性,为BMSC治疗TBI步入临床奠定基础。 本研究分为三个部分。第一部分研究是通过原代贴壁培养法获得性状稳定的大鼠BMSCs,利用流式细胞术检测其表面标记抗原,我们进一步通过体外诱导的方法检测rBMSCs的向成骨细胞、成脂肪细胞和神经样细胞方向的分化潜能。研究结果显示,原代rBMSCs易于提取和体外纯化、扩增,鉴定其标记物符合BMSCs的特征,其在体外能可通过诱导向脂肪样细胞、成骨样细胞及神经元样细胞分化,提示其具有多向分化潜能,证实rBMSCs培养成功。 第二部分研究是通过转染pLXSN质粒介导的人端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase hTERT)来增强BMSCs端粒酶的活性,获得了Ad5-hTERT调控的永生化大鼠BMSC,利用ELISA方法检测转染细胞的端粒酶活性。同时,通过构建腺病毒介导的BDNF高效表达载体Ad5-BDNF,将Ad5-BDNF复合体转染至hTERT-BMSC,证明了转染BDNF的永生化BMSC在体外具有一定程度的损伤细胞修复作用,为Ad5-BDNF-BMSC的体内实验奠定基础。 第三部分研究中我们选取国际上较为普遍采用的大鼠液压颅脑损伤模型,在1.5-2.0atm条件下制备大鼠中型颅脑创伤模型,同时借助于立体定向细胞移植技术,将共转染BDNF和hTERT基因的BMSCs移植到损伤脑组织区,观察细胞移植治疗后大鼠生存期变化、神经损伤评分(neurologic severity score, NSS)的变化以及损伤区脑组织水肿在核磁共振成像(MRI)的变化,评价基因修饰的BMSCs在大鼠液压颅脑创伤模型体内的安全性和对TBI治疗的有效性,为BDNF和BMSCs联合治疗TBI步入临床奠定基础。 上述研究结果表明：大鼠BMSCs易于分离、培养和扩增,长期体外培养BMSCs可出现过早老化和过度增殖等生物学性状不稳定现象；hTERT正以表达载体pLXSN-S-hTERT转染至大鼠BMSC,可以使BMSC的端粒酶活性增强,促进BMSCs增殖,并保持在长期传代培养过程中形状稳定性,是建立BMSCs永生化细胞系的安全可靠而有效的方法；Ad-BDNF-hTERT-BMSCs在体内外可以高表达BDNF,能够有效减少受损神经元的的凋亡,提高脑损伤大鼠的生存率,并能促进其神经功能的康复,为BDNF和BMSCs治疗TBI步入临床奠定基础。
【图文】：

涡状排列、折光性强、生长增殖较快。 ABCDE图1一 2rBMSCs在原代贴壁培养法不同时间点的形态学观察(、100)A、自骨髓腔冲洗出所有髓内细胞成分，可见大量圆形单个细胞。B、培养7天后梭形折光性强的贴壁细胞逐渐增多，部分细胞未贴壁。C、D培养14天后贴壁细胞生长旺盛，呈梭形，汇集成片，，呈铺路石状。E、第5代细胞形态基本均一，胞体呈梭形，折光性良好，生长旺盛。原代提取培养10一14天后，贴壁细胞接近90%汇合，1:2传代，之后每隔4~5天1:2传代。第2~4代的贴壁细胞成分依然复杂

涡状排列、折光性强、生长增殖较快。 ABCDE图1一 2rBMSCs在原代贴壁培养法不同时间点的形态学观察(、100)A、自骨髓腔冲洗出所有髓内细胞成分，可见大量圆形单个细胞。B、培养7天后梭形折光性强的贴壁细胞逐渐增多，部分细胞未贴壁。C、D培养14天后贴壁细胞生长旺盛，呈梭形，汇集成片，呈铺路石状。E、第5代细胞形态基本均一，胞体呈梭形，折光性良好，生长旺盛。原代提取培养10一14天后，贴壁细胞接近90%汇合，1:2传代，之后每隔4~5天1:2传代。第2~4代的贴壁细胞成分依然复杂
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 胡静波;周燕;蒋丹丹;谭文松;;体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞的增殖与分化规律[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年01期

2 洪新如,陈新民,卢晓欣;不同时间脑室注射脑源性神经营养因子治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤效果的比较[J];中国药理学通报;2002年02期

3 项鹏,夏文杰,王连荣,陈振光,张丽蓉,张秀明,李艳,李树浓;丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞[J];中山医科大学学报;2001年05期

4 胡德志,周良辅,朱剑虹;大鼠骨髓基质细胞脑池移植对创伤性脑损伤的治疗效应的研究[J];中国神经精神疾病杂志;2004年05期

本文编号：2582957