人纤溶酶原K5在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达、纯化与生物学活性研究

发布时间：2020-03-18 21:57

【摘要】：利用血管生成抑制来治疗肿瘤是目前研究的热点之一。纤溶酶原K5(Plasminogen K5，Pgn K5)是一种新发现的血管生成抑制蛋白，具有明显的血管生成抑制作用，但Pgn K5的抗肿瘤活性尚待确定，此外，选择何种表达系统制备足够的量进行体内抗肿瘤活性研究还需要进一步探索。本论文就Pgn K5在原核和真核系统的表达、纯化及生物学活性的测定等进行了系统详细的研究。 首先，按照酵母细胞遗传密码偏爱性设计并人工合成hK5(人Pgn K5)的全基因，插入大肠杆菌表达载体pThioHisA，以硫氧还蛋白融合蛋白的形式实现高效表达。经肠激酶切割和纯化，获得了与天然蛋白N-末端相同的hK5重组蛋白。 另外，将hK5基因插入毕赤酵母整合型表达质粒p819的醇脱氢酶(AOX)启动子下游，构建携带8拷贝hK5表达盒的重组载体，经电转化GS115菌株和G418筛选，得到了高效分泌表达hK5的毕赤酵母菌株，表达量超过150mg／L，通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤纯化，使重组蛋白达到很高的纯度。 最后，对大肠杆菌和毕赤酵母表达的hK5的活性进行鉴定。Ecv304细胞(人脐静脉内皮细胞来源的细胞系)生长抑制实验表明，hK5以剂量依赖的方式特异性地抑制血管内皮细胞的生长。鸡胚尿囊膜实验中，hK5可显著抑制新生血管的形成。T739小鼠肿瘤模型实验表明，重组hK5可显著降低小鼠肿瘤的生长速度。 本研究首次报道了重组hK5在大肠杆菌和毕赤酵母系统中的表达以及体内抗肿瘤活性测定，为hK5的活性机理研究和新型抗血管生成药物开发奠定了基础。
【图文】：

中国医学科学院中国协和医科大学博士研究生圈1.8助KS融合蛋白亲和层析纯化Figl.SA击正yt山mooatgra讨WPur迅。丽曲of公区susfnoiProtoni

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【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2589243