利用基因芯片技术及抑制性削减杂交技术研究神经鞘氨醇磷酸胆碱对人真皮成纤维细胞基因表达的影响

发布时间：2020-03-19 07:13

【摘要】：神经鞘氨醇磷酸胆碱（Sphingosylphosphorylcholine,SPC）是神经鞘磷脂的一种代谢产物。人们开始发现SPC是Niemann Pick病（NPD）中沉积的鞘脂类，后来发现SPC有很强的促有丝分裂作用，明显促进3T3成纤维细胞DNA合成，且能增加细胞数。这种促有丝分裂作用明显强于表皮生长因子、胰岛素等，而且与它们有协同作用。在愈合能力差的糖尿病小鼠实验中证实，SPC具有促进多种细胞增殖、伤口愈合和减少瘢痕形成等作用，从此SPC受到很多学者的关注。最近发现SPC促进细胞的移动，诱导成纤维细胞表达与细胞移动有关的血纤维蛋白溶酶原激活剂。有实验证实SPC不仅在创伤愈合的组织形成期起作用，而且在组织再塑期同样起重要的作用。可见，SPC在创伤愈合的多个阶段均起重要的促进作用。创伤愈合是非常复杂的生物学过程。本研究利用基因芯片技术和SSH技术，重点研究了SPC刺激人皮肤成纤维细胞时基因表达谱的变化，在基因水平上研究SPC促进创伤愈合的机理，同时研究了SPC刺激人皮肤成纤维细胞诱导表达CTGF时部分信号传递途径。结果如下： 1. SPC对原代培养的人皮肤成纤维细胞DNA合成影响（1）SPC对原代培养的成纤维细胞DNA合成的促进作用有浓度依赖性； WP=101 低浓度时有促进作用即 2μM时就有促进作用，5 μM 时达最高值，超过20 μM时则出现毒性作用，DNA合成不仅不增加反而出现细胞退化。（2）SPC以5 μM浓度处理24h、48h、72h后DNA合成速度明显较对照组高，这表明SPC处理长达72h 时，SPC仍有明显的促进DNA合成作用，这种持久性的作用有可能与它的长半衰期（半衰期18 h）有关。利用基因芯片技术研究SPC作用人皮肤成纤维细胞时基因表达谱的变化基因芯片的8096个基因中有意义的信号位点有194个，其中表达增加 2倍以上的基因为52个、表达减少一半以下的基因为49个。根据基因功能初步将它分为11类: 第一类是与细胞增殖有关的基因，共3个；第二类是与细胞骨架、细胞移动、细胞外基质产生等有关的基因，共16个；第三类是转录因子及转录因子激活剂，6个; 第四类为核糖体蛋白，1个；第五类为抑制肿瘤有关的基因，共3个；第六类是免疫、炎症和细胞因子有关的基因，共4个；第七类是代谢有关的基因，共7个；第八类是DNA、蛋白等结合有关的基因，共5个; 第九类是凋亡及应激蛋白有关的基因，共1个；第十类是离子通道有关的基因，共5个；第十一类是其他功能或不知功能的基因，共17个；11类基因中7类基因可能与创伤愈合有关，其中与创伤愈合密切关联的几个基因是CTGF、Cyr61、 PA、 PAI、 IL-6、 tubuline、 actin like- 7A、 transgelin、 TNF-α-induced protein 6 等。这些基因中CTGF表达水平最高，因此我们认为SPC 促进创伤愈合过程中CTGF是重要的下游因子。 3. 利用SSH方法研究SPC作用人皮肤成纤维细胞时差异表达的基因 WP=102 采用SSH技术从 SPC处理组的264个白色菌落中查出28个差异表达克隆，从对照组的196个白色菌落中筛查出26个差异表达克隆。利用Northern 印迹，从 SPC处理组差异表达的28个克隆中确定了6个差异表达基因，对照组26个差异表达克隆中没有确定差异表达克隆。对6个差异表达克隆插入序列的分析表明, 克隆FBSPCT02G 的同源性基因是 Homo sapiens thrombospondin 1 -THBS1,克隆FBSPCT04A的同源性基因是Homo sapiens transferrin receptor -TFRC，克隆FBSPCT04H的同源性基因是 H.sapiens mRNA for oxytocin receptor，克隆FBSPCT07E的同源性基因是Homo sapiens zinc finger transcription factor-ZNF207 mRNA, 克隆FBSPCT06E的同源性基因是 Homo sapiens matrix metalloproteinase 2 -MMP2，克隆FBSPCT08F是新基因。 4. 利用Northern 印迹技术分析SPC处理后人皮肤成纤维细胞CTGF mRNA的表达以不同浓度的SPC作用人皮肤成纤维细胞时，CTGFmRNA的表达随着SPC的浓度的增高而增高。SPC的浓度为1μM~5μM时，CTGFmRNA表达明显较0 μM时高，10μM时CTGFmRNA表达有下降趋势，但仍处于较高水平。当SPC浓度为5μM，观察不同作用时间对CTGFmRNA表达的影响，，发现作用时间为3h时CTGFmRNA表达没有明显的变化，6h时CTGFmRNA表达明显的较0h 增高，12h时CTGFmRNA表达继续保持在较高水平，但24h时CTGFmRNA表达显著下降。 WP=103 5. 利用Western 印迹分析SPC处理后人皮肤成纤维细胞CTGF蛋白表达不同浓度的SPC 处理24h后观察CTGF蛋白表达。当SPC浓度为0.5 ??到???时，在38 kDa分子量位置上出现阳性条带，均较0??表达增高。利用Northern 印迹技术分析放线菌酮预处理后SPC 诱导CTGFmRNA表达的变化当单用SPC处理时CTGFmRNA表达较对照组显著增高。单用蛋白合成抑制剂放线菌酮（cycloheximide -CHX)以 10 ?g/ml CHX处理时，CTGFmRNA表达明显较单用SPC处理组增高。当SPC与CHX同时处理时，CTGFmRNA表达更加显著，较单用CHX处理组高。这结果提示SPC诱导CTGFmRNA表达是直接作用于CTGFmRNA转录，且 SPC诱导CTGFmRNA表达时受某些因子的抑制，当放线菌酮（CHX）抑制了这些因子时CTGFmRNA的表达增高。 7. 利用 RT-PCR方法分析百日咳毒素预处理后SPC 诱导人皮肤成纤维细胞CTGFmRNA表达不同浓度
【图文】：

溶血磷脂,类化,结构式,磷酸胆碱

亲和力的 SPC- GPCRs 已被鉴定。这些受体不被 S1P 所激活[12，13]，而且也证明了 SPC 在正常的血浆中可以检测到。1． SPC 的结构与作用机制1．1 SPC 的结 SPC 由鞘氨醇及磷酸胆碱所构成。分子式：C23H49N2O5P，分子量：464.6，在体内还有很多结构上与 SPC 相近且生理学作用也较相近的溶血磷脂类（见图 1）。

受体,百日咳毒素,低亲和力,神经鞘

图 2. SPC 作用的分子生物学机制1．2. 1 G-蛋白耦联 SPC 受体（G-protein-coupled SPC receptors）就象 S1P，G-蛋白耦联受体抑制剂百日咳毒素（pertussis toxin PTX）阻断 SPC 对细胞的作用；这个现象可以提示，SPC 是通过 GPCRs 对细胞起作用的[14]。在豚鼠心肌细胞第一次证明了特异性神经鞘脂-GPCR 存在的事实。S1P 在 nM 水平上以 GTP 依赖形式激活细胞膜外侧面的 muscarinic current channels (Ik(Ach)) Ik.Ach[15]。SPC 也高度类似的方式激活 Ik.Ach[16]，可以提示 SPC 与 S1P 作为配体对此受体均有高亲和力的，但是后来证明 ED家族的 S1P 受体对 SPC 来说是低亲和力的（见表 1）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【共引文献】