A型流感病毒RNA节段特异性非编码区在病毒复制中的作用研究

发布时间：2020-03-19 08:22

【摘要】：流感(Influenza)是一种严重威胁人类健康和公共卫生安全的呼吸道传染病,A型流感病毒(influenza A virus, IAV)是其主要病原体。IAV是一种基因组分8个节段的单股负链RNA病毒,各基因组片段RNA的主要结构组成包括一个长的编码区和位于两端较短的非编码区。从基因的分类来看,流感病毒基因属于真核基因的范畴,而真核基因的非编码区序列作为重要的顺式作用元件对基因的表达调节发挥着重要的作用。但是,目前对流感病毒基因组非编码区在病毒基因表达调节过程中所发挥的作用还缺少系统性研究。而这一问题的深入研究,对于我们进一步了解病毒的复制与致病机制有重要理论意义,也将为疾病的防治工作提供重要信息。 在本研究中,我们通过生物信息学方法,对流感病毒各基因片段的非编码区进行了大规模序列比对分析,全面展示了流感病毒非编码区的序列特征。在此基础上,我们在流感病毒小型复制子系统中研究了各基因片段的非编码区对于病毒RNA合成和蛋白表达的影响。结果表明,流感病毒各基因片段的非编码区不但对病毒RNA合成有着重要影响,而且能够在翻译水平上对病毒蛋白的表达发挥着调节作用。其中最为明显的是,PB1基因非编码区在翻译水平介导了相对低水平的蛋白表达。 我们的研究发现,在PB1基因的非编码区内,以基因-3位碱基“U”为特征的非优势Kozak序列导致了PB1非编码区在翻译水平介导了蛋白的低水平表达。通过在该位点引入-3U-A突变优化PB1基因的Kozak序列,虽然能够提高突变病毒在感染过程中PB1蛋白的表达量,但该突变病毒在复制过程中所能达到的最高滴度要比野生型病毒低10倍,即呈弱毒表型。进一步的研究表明,优化PB1基因的Kozak序列所引起的PB1蛋白的过表达,不但致使突变病毒RNA合成动态发生改变,而且使得突变病毒诱导宿主细胞产生了较高水平的Ⅰ型干扰素。 另外,我们对流感病毒非编码区中毗邻于病毒启动子的保守碱基(3’端13-14位碱基与5’端14'-16’位碱基)的功能进行了研究。结果表明,3’端13位碱基与5’端14’位碱基所形成碱基配对使得启动子的“茎”部进一步得到了延伸,这对于病毒启动子功能的发挥非常关键。同时,研究结果也提示我们,这些保守的碱基序列还可能参与了如病毒基因组RNA的包装等病毒复制周期中的其他过程。 总之,本研究全景展示了流感病毒各基因片段非编码区的序列特征,并比较全面地研究了其对于病毒RNA合成与蛋白表达的影响。在此基础上进一步揭示了PB1非编码区在翻译水平上介导PB1低水平表达的机制和生物学意义,即流感病毒在长期的进化过程中,其PB1基因获得了一个高度保守和特异的非优势Kozak序列来调节PBl蛋白的表达量,从而优化病毒复制动力学和避免过度激活宿主抗病毒天然免疫应答。另外,我们还初步揭示了病毒片段特异性非编码区中毗邻于病毒启动子的保守核苷酸残基的功能。上述研究的完成,进一步丰富了我们对于A型流感病毒非编码区的认识,也为我们理解A型流感病毒的基因表达调控和病毒免疫逃避机制提供了一个新的视角。
【图文】：

导致流感的大流行。在过去500多年中，从1510年起，世界范围内大约有14次A型流感病毒的大流行（图1-4)。而在过去的120年中，A型流感病毒大流行分别发生在1889年、1918年、丨957年、1968年、1977年和2009年丨丨63!。在1918年第一次世界大战期间，世界范围内爆发了人类有记载历史上最为严重的一次流感大流行。据估计,此次大流行在世界范围内导致将近5 T?万人死亡,而仅在美国就有将近67.517

唆（Uridine, U)组成的序列。这一段序列被证明是病毒在合成mRNA过程中，是在3'加Pol(A)尾的多聚腺苷酸化信号序列(如图1-5)[179]。ssNCRs Coding region ssNCRs3,、丨 I穴^UUUU图1-5流感病毒基因组结构意图1.2.2流感病毒非编码区内的病毒启动子过去的大量研究己经表明，流感病毒基因组RNA高度保守的3'端的12个核苷酸残基和5'端的13个核苷酸残共同形成了流感病毒的vRNA启动子3'端保守的10-12位核苷酸残基与5'端11'-13'位保守的核苷酸残基通过碱基互补配对使得病毒RNA首尾相连形成一环状状结构此外，，人们还发现，3'端和5'端的莲-环结构对于流感病毒启动子功能有重要作用。首先，3'端和5'端的莲-环结构的存在是流感病毒聚合酶发挥其内切酶活性从宿主细胞mRNA _h获取帽子结构的关键；另夕卜，5'端的莲-环结构对于病毒mRNA的末端的多聚腺苷酸化非常重要而且，研宄也已经表明，这些莲-环结构起到了病毒RdRp结合与固定的作用II87]。所以科学家提出了现在已经被人们广泛接受的流感病毒启动子的Corkscrew结构模型[184.188](图 1_6)。20
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.13


本文编号：2589974