【摘要】：世界范围内,宫颈癌是妇女第二高发肿瘤。持续性高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是引发宫颈癌的主要原因。目前鉴定的高危型HPV有15型,其中HPV16,18是世界范围内的优势流行株,HPV58是东亚地区、中美和南美地区优势流行的病毒株。目前上市的以HPV主要蛋白L1为基础的病毒样颗粒(VLP)疫苗,主要诱发型别特异性中和抗体,仅可预防两种高危型病毒(HPV16,18)感染及相关病变,对其他型别没有交叉保护作用或交叉保护作用弱。目前缺乏HPV58LI VLPs诱发长期中和抗体的报道,且尚未见含HPV58L1VLPs的疫苗问世。次要蛋白L2存在保守交叉中和抗体表位,但其免疫原性很弱。由于HPV L1VLPs可直接活化DC细胞,且VLP表面的表位是高度规律性重复排列的,因此在VLP表面展示L2保守表位,获得的嵌合病毒样颗粒(cVLP)疫苗可望扩展现有VLP疫苗的保护范围。为了拓宽现有疫苗的保护范围,本研究第一部分进行含HPV58型的HPV16/18/58混合型VLP疫苗的研究,第二部分进行了以HPV16LI VLPs为载体的嵌合L2表位疫苗的研究。 本研究在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了HPV16,18,58L1VLPs,对各型VLPs进行了纯度、形态学及免疫原性的研究,特别是HPV58L1VLPs诱发长期中和抗体活性及协同Al(OH)3佐剂的相关研究,并比较了超离法与层析法纯化HPV LI VLPs均一度及免疫原性的区别。在此基础上,表达及纯化了以HPV16L1VLPs为载体的嵌合各种HPV16L2保守表位的杂合蛋白,并对影响杂合L1组装能力及其诱发中和抗体活性的因素进行了研究。具体结果如下： 1.层析法纯化获得的人乳头瘤病毒(HPV)16/18/58病毒样颗粒疫苗的实验研究 1.1HPV16,18,58L1VLPs的纯度、形态学及表位特征的分析 经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色、ELISA及Western blot(后两种方法分析Sf9宿主残留蛋白)分析结果表明,层析法获得的HPV16,18,58L1VLPs纯度分别为99.5%,97.8%,98.4%。经透射电镜和动态光散射分析,HPV16,18,58L1蛋白都组装成了与天然病毒类似的均一度很高的VLPs,直径范围分别为45-70nm,40-68nm,40-65nm。 ELISA结果表明HPV16L1VLPs保留了人群免疫优势的构象依赖的中和抗体H16.V5识别的表位,HPV18,58L1VLPs分别保留了构象依赖的中和抗体H18.J4, XM58-7识别的表位。以上结果表明在Sf9中表达纯化的HPV L1VLPs纯度很高,形态结构与天然病毒类似,均一度高。 1.2层析法与超离法获得HPV L1VLPs的比较 经动态光散射分析,层析法获得的HPV L1VLPs在水溶液中为单一的峰,而CsCl超离法获得的VLPs为一个或多个峰。且超离法获得的HPV L1VLPs水力学直径比层析法的大,表明层析法获得的HPV L1VLPs比较均一,超离法获得的VLPs可能存在聚集。将超离法和层析法获得的HPV16L1VLPs分别免疫小鼠,结果表明,层析法获得的HPV16L1VLPs诱发的中和抗体比超离法的高,提示层析法纯化获得的HPV16L1VLPs具有很好的免疫原性。 1.3HPV16,18,58L1VLPs免疫原性及HPV58L1VLPs诱发长期中和抗体的分析 HPV L1VLPs免疫小鼠测定ED50,结果表明仅需分别免疫0.0275μg的HPV16L1VLPs,0.0172μg的HPV18L1VLPs,0.1140μg的HPV58L1VLPs就能使50%的小鼠阳转。将HPV16,18,58L1VLPs单独或混合免疫小鼠诱发了较高滴度的针对组成型别的中和抗体,且单价组与三价组诱发的中和抗体没有统计学差异。同时,低剂量(0.1μg)的HPV58L1VLPs在单价组和三价组均诱发了长达48周的高滴度(103以上)的中和抗体。以上结果表明HPV16,18,58LI VLPs免疫原性很强。 1.4Al(OH)3佐剂及其剂量对HPV L1VLP疫苗活性的影响分析 取HPV16,18,58L1VLPs,分别采用低剂量(0.1μg)或高剂量(2μg)配制单价和三价疫苗,单独或协同Al(OH)3佐剂免疫小鼠。血清中和抗体分析结果表明,仅在低剂量组,协同Al(OH)3佐剂能显著增强单价和三价疫苗中HPV16,18L1VLPs免疫原性。但是不能显著增强HPV58L1VLPs的免疫原性。 取HPV18L1VLPs与不同剂量的Al(OH)3佐剂(抗原：佐剂为1：6到1：1000)协同免疫小鼠,结果表明HPV18中和抗体的滴度随着Al(OH)3佐剂剂量的增加增高。以上结果表明,Al(OH)3佐剂可增强HPV L1VLP疫苗的诱发中和抗体的水平,在一定范围内,佐剂剂量越高,HPV L1VLPs诱发的中和抗体滴度越高。 2.人乳头瘤病毒(HPV)16嵌合病毒样颗粒疫苗的初步研究 2.1HPV16L1-L2重组杆状病毒转移载体的构建与表达鉴定以HPV16L1基因为模板,利用overlap PCR扩增获得在HPV16L1DE loop (aa.136/137)或H4C端(aa.430/433)插入单表位的HPV16L2aa.56-75(sE),分别命名为DE/sE,H4/sE,同理在这两个位置插入两个拷贝的HPV16L2aa.17-36(dE)的为DE/ddE, H4/ddE,在DE loop插入HPV16L2aa.17-36与aa.56-75串联双表位的为DE/sdEo将测序正确的HPV16L1-L2杂合基因装载到pFastBac1载体,利用杆状病毒昆虫细胞表达体系,在Sf9细胞中表达HPV16L1-L2杂合蛋白,并用层析法进行了纯化。 2.2HPV16L1-L2杂合蛋白纯品的鉴定 电镜分析结果表明H4/sE组装成了VLPs且形态较规则。DE/ddE为五聚体,DE/sE, H4/ddE为VLPs和L1聚集物的混合体,DE/sdE为五聚体和L1聚集物的混合体。以本实验室制备的Sf9HCP兔多抗为一抗做Western blot,结果提示,DE/ddE, DE/sE, H4/sE的纯度达到90%以上,DE/sdE纯度为80%-90%。 2.3HPV16L1-L2杂合蛋白诱发HPV16中和抗体的分析 将HPV16L1-L2蛋白协同弗氏佐剂免疫小鼠,检测结果表明,HPV16LI VLPs, H4/sE, DE/sE, H4/ddE, DE/ddE, DE/sdE诱发的骨架型别特异性的HPV16中和抗体滴度依次为3.2×104,1.8×104,2.7×103,1.2x102,5×101,50。可以看出H4/sE, DE/sE诱发的HPV16中和抗体滴度比H4/ddE, DE/ddE的高,表明在DE loop和H4C端插入sE比插入ddE对骨架的影响小。无论在H4C端插入sE还是ddE,均比在DE loop插入相同的位点诱发的中和抗体滴度高。表明H4C端比DE loop更耐受外源表位的插入。 总之,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统,层析法纯化获得了纯度高、形态结构与天然病毒类似、免疫原性强的HPV16,18,58L1VLPs;低剂量HPV58L1VLPs在单价和三价疫苗中均可诱发持久高滴度的HPV58特异性中和抗体。本研究结果为含HPV58的多价VLP疫苗的研发奠定基础。有关HPV16L1不同表面区容纳L2保守中和抗体表位的能力及其诱发中和抗体活性的研究将有利于广谱HPV cVLPs的研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R737.33;R392
【共引文献】
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本文编号：
2643630
