MFFP的构建及其对T2DM及血栓并发症模型小鼠的疗效学研究

发布时间：2020-05-11 20:56

【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及机体对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱疾病。其主要临床特征为血糖高、血脂高以及高粘血症等,被称为“百病之源”。随着人们生活水平的提高,近年来糖尿病发病率呈现逐年上升趋势。因此,寻找更好的糖尿病治疗药物、给药途径和治疗方法是学术界亟待解决的重要课题。糖尿病除了其本身的危害以外,往往还会带来一系列的并发症,这些并发症给患者带来了更为严重的后果。糖尿病患者死亡率最高的为心脑血管病变,约占80%,其中血栓的发病率为非糖尿病人的12倍。因此,在糖尿病的治疗中,找到一种治疗糖尿病同时又能有效预防和治疗心脑血管疾病血栓等并发症的治疗方法或药物具有十分重要的意义。胰高血糖素样多肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。GLP-1具有促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌、减少食物摄取、减慢胃排空,以及抑制胰高血糖素分泌、刺激胰β细胞增殖、促进胰岛再生、抑制胰β细胞的凋亡等特殊功能。葡萄糖依赖性促胰岛素释放激素(glucose-dependent insμlintropic polypeptide, GIP)是由肠道K细胞合成和分泌的由42个氨基酸组成的多肽。具有促进第一时相胰岛素的分泌,改善胰岛素敏感性,刺激胰β细胞再生,延缓胰岛素清除等作用,对2型糖尿病具有良好的治疗效果。水蛭素(Hirudin, HV)是从医蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分离的一种酸性小分子蛋白,是目前发现的最好的凝血酶抑制剂,在预防和治疗人类心脑血管疾病方面有着非常显著的疗效,是治疗心脑血管疾病的首选良药。本研究通过定点突变技术将天然GLP-1基因内部的第8位的Ala替换成Ser,以抑制二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPP-Ⅳ)对其降解,并分别将第26位的Glu和第34位的Asp替换成Lys抑制胰蛋白酶的切割,克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶切割的GLP-1同源物,命名为重组口服长效GLP-1(recombinant oral long-acting GLP-1, rolGLP-1)。通过分子克隆手段将GIP第2位的Ala用Gly替换,获得抗DPP-Ⅳ切割的重组GIP (recombinant glucose-dependent insμlintropic polypeptide, rGIP)和重组HV(recombiant Hirudin,rHV)。将多拷贝的rolGLP-1基因分别与多拷贝的rGIP基因和单拷贝的rHV基因串联,分别获得4rolGG(4rolGLP-4GIP)、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV基因,将基因克隆到pET22b(+)载体后,分别获得表达载体pET22b(+) pET-22b(+)-5rolGZP-4GIP和pET-22b(+)-5rolGLP-HV,转化转化大肠杆菌BL21(DE3)。转化的工程菌株经IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析证明均实现了这些融合多肽的高效可溶性表达。对其诱导表达条件进行优化,结果表明：rolGG最佳表达条件为IPTG浓度为0.6mmol/L、温度为30℃下培养10h;4rolGG最佳表达条件为在IPPTG终浓度为0.2mmol/L,温度在37℃下诱导5h；5rolGLP-4GIP最佳表达条件为在IPTG终浓度为0.4mmol/L,温度在30℃下诱导10h;5rolGLP-HV最佳表达条件为IPTG终浓度为0.4mmol/L,温度在37℃下诱导5h；菌体裂解液经超生破碎后,上清经过Ni金属亲和层析进行纯化,分别获得纯度较高的rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽,为以后功能的验证奠定了良好基础。 rolGG体外切割实验证明,rolGG在体外可以被修饰性胰蛋白酶切割成rolGLP-1和rGIP,切割率达到70%。采用STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型分别对rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽的降血糖功能进行了检测。结果表明：与0.9%NaCl处理的阴性对照组小鼠相比,rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV等融合多肽均可有效地降低血糖和甘油三脂、胆固醇的水平,并改善口服糖耐量,糖化血红蛋白以及胰岛素的分泌情况,并可有效改善糖尿病小鼠的多饮、多食和体重减轻等症状。采用凝血酶滴定法检测rolGLP-HV的抗凝活性,结果表明5rolGLP-HV的抗凝活性为105±1.7ATU/ml,证明5rolGLP-HV融合多肽具有HV的抗凝血功能。采用血栓模型对5rolGLP-HV融合多肽的抗血栓活性进行了检测。在昆明小鼠背部皮下注射角叉菜胶(50mg/kg)的同时给小鼠灌胃5rolGLP-HV融合多肽,观察小鼠尾部出现血栓的时间及血栓的相对长度。结果发现,灌胃5rolGLP-HV融合多肽的小鼠出现血栓的时间比对照延迟致32h,相对长度从37.5%缩减到25%,说明口服5rolGLP-HV融合多肽确实可以起到抗血栓作用。本研究为功能互补型双元促胰岛素rolGG以及多拷贝功能互补型双元促胰岛素4rolGG和5rolGLP-4GIP口服融合多肽类药物的研发提供了较完善的实验和理论依据,并为利用口服重组融合多肽来防治2型糖尿病的临床研究和应用奠定了基础。本研究结果亦表明,5rolGLP-HV融合具有明显的治疗和预防糖尿病及血栓的双重功能,有望研发成为治疗糖尿病和心脑血管病的双功能口服药物,为今后5rolGLP-HV融合多肽的临床前应用研究奠定了坚实基础。
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.2;R-332

【参考文献】