miR-206-3p在小鼠皮肤发育中的作用探讨

发布时间：2020-05-12 03:05

【摘要】：在胚胎发育的一定时期,皮肤神经末梢可以抵达表皮层的表面,从而与羊水直接接触,随即出现神经过支配后的撤消现象,而对这一发育现象十几年来尚无有关形成机制的研究报道。为此,本研究拟从检测小鼠不同孕期羊水中microRNAs (miRNAs)差异表达谱着手,以探寻miRNAs对皮肤神经发育的作用。首先,以羊膜腔穿刺术采集13.5dpc(交配后天数)、15.5dpc及17.5dpc雄性胎鼠的羊水,经4℃下16000×g离心10min以去除细胞及细胞碎片成分,将其上清用TRIzol(?)法提取总RNA,使用基于LNATM探针的miRNAs表达谱芯片进行检测,对此胚胎期3个时间点的miRNAs表达数据进行k-medians聚类,再按表达强度排序,最终选取了可能与皮肤功能有关的miR-206-3p,乍为本研究的目标miRNA。随后,以小鼠胚胎12.5dpc时的骨骼肌、皮肤与大脑组织作为检测样本,建立了基于茎环法RT-qPCR的miR-206-3p定量检测方法。同时,对固定非包埋处理的胚胎组织,进行多个管家基因(Snord68, Rnu6, Gapdh, Hprt, Actb)多种片段长度(92bp～349bp)的RT-qPCR扩增,并选用不同内参基因进行miR-206-3p的表达数据分析。结果显示：1)经-20℃甲醇/DMSO固定保存的胚胎样本,其RNA可扩增片段长度至少为349bp,所获得的表达分析结果与新鲜冻存组织无异,可用于mRNA与miRNA的RT-qPCR检测；2)12.5dpc胎鼠皮肤中miR-206-3p的表达水平约为同期骨骼肌的1/4。鉴于niR-206-3p可通过转录后调控脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的生成,参与胚肺气道平滑肌的神经支配过程,推测皮肤神经支配过程也可能存在与此相似的调控机制。为此,对13.5dpc/15.5dpc/17.5dpc台鼠、1dpp(出生后天数)/4dpp乳鼠及16周龄雄鼠的背部全层皮肤,以RT-qPCR法检测miR-206-3p与Bdnf mRNA的表达水平,western blotting检测BDNF蛋白表达水平,原位杂交(ISH)与免疫组化(IHC)分别检测miR-206-3p与BDNF的组织定位。结果发现miR-206-3p在小鼠皮肤发育过程中呈现以17.5dpc为中点的“山峰形”表达模式,明显有别于骨骼肌中的“S形”升高趋势；BDNF蛋白表达趋势与miR-206-3p相反,而BdnfmRNA在17.5dpc至成体期并无显著改变；miR-206-3p的分布在皮肤发育过程中逐渐区域化,在出生后主要分布于上基部和毛囊外周,与同期BDNF表达区域毗邻但不重叠。据此认为,miR-206-3p可能通过转录后调控BDNF的生成,参与了小鼠皮肤神经发育过程。 miR-206-3p在皮肤发育过程中所分布的区域,也是角质形成细胞(KC)开始发生角质化或与真皮组织接触之处,如此提示miR-206-3p的表达可能与KC的功能特化有关。为进一步明了miR-206-3p分别在表皮与真皮组织中各自的基础表达情况,对这两种组织的主要细胞,KC与真皮成纤维细胞(DF)分别进行原代培养后,再进行有关表达分析。结果显示,KC的miR-206-3p表达水平远低于DF(t-16.618,P=0.000,n=6),其Bdnf mRNA的表达与DF相近(t=-2.632,P=0.058,n=6),而pro-BDNF的表达要高于DF(t=-9.222,P=0.001,,n=6),其成熟型BDNF的生成量也高于DF(t=4.841,P=0.008,n=6)。KC经1mM钙离子诱导5天后,其miR-206-3p的表达略有增加,但尚无统计学差异(t=-1.721,P=0.227,n=3)；Bdnf mRNA及蛋白表达水平,在KC分化前后无明显改变(Bdnf mRNA:t=-2.640,P=0.118；mature BDNF:t=-2.815,P=0.106；pro-BDNF:t=0.135,P=0.905；n=3)。由此推断,miR-206-3p在皮肤中的表达,不是作为表皮的自身发育信号,而是表皮在受到其它组织影响后需要作出功能转变的一个调控环节。最后,本研究通过剪取(?)5mm全层皮肤建立小鼠皮肤切除伤模型,以排除毛囊、腺体等附属器在皮肤生成中的因素,再对成年小鼠皮肤创伤后第6、9、12天时的修复组织进行miR-206-3p及Bdnf的表达与定位检测。结果显示,在皮肤创伤修复过程中,miR-206-3p的表达一直处于较低的水平,ISH未显示有明显表达区域：而Bdnf mRNA及蛋白的表达经历了先降低后增高的过程,IHC显示BDNF在伤后第12天时表达于上基部。miR-206-3p在皮肤胚胎期发育与成体期创伤修复中的表达情况既有区别也有联系。胚胎期皮肤中的miR-206-3p通过转录后调控BDNF的表达,以建立与调整神经支配区域从而完成皮肤神经的发育。而成体期皮肤创伤修复中miR-206-3p的这种调控作用,则只体现在对修复后期神经支配的合理控制上。本研究对miR-206-3p在皮肤发育中所进行的探索与发现,为这个骨骼肌特异性miRNA增添了新的认识与理解,使我们有幸从miRNAs视角,探讨皮肤神经支配建立与调整的可能机制。对于miR-206-3p可能参与皮肤神经发育现象的发现,为miRNAs的组织特异性调控作用提供了新的证据,对皮肤神经生理功能的建立具有重要启示。进一步对表皮细胞中miR-206-3p的表达进行人工干预,将有可能揭示某些皮肤疾病的发病机制,并有望成为临床干预治疗的新手段。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

【参考文献】