基于iTRAQ技术IVF子代脐静脉差异蛋白研究

发布时间：2020-05-12 08:05

【摘要】：1.研究目的：尽管已经有研究结果显示IVF子代会出现血管代谢紊乱、全身性和肺循环功能紊乱以及心血管结构的重塑,但是这方面的机制尚且缺乏研究。我们的课题首先针对中国3-13岁的IVF子代及其条件吻合的对照组子代进行了大样本的血压监测；然后借助脐静脉来模拟子代血管,试图从蛋白水平上发现差异功能蛋白；关于IVF子代后期生长发育中发生紊乱的原因,目前说法不一,有人认为是IVF技术本身导致,有人认为是不孕因素导致,而我们的研究最后试图通过临床和基础研究相结合的方式来发现这些蛋白差异表达的原因,从而挖掘出IVF子代血管功能紊乱的机制。 2.材料和方法： (1)对在浙江大学医学院附属妇产科医院借助IVF技术和自然妊娠出生的3-13岁的子代进行随访,以新鲜胚胎移植出生的单胎为实验组,以同期相应的自然妊娠出生的单胎作为对照组,对其身高、体重、BMI、收缩压、舒张压和心率进行统计分析。所选的IVF均为管性不孕,另外两组均排除子代出生时血管功能缺陷、家族型血管疾病、妊娠高血压和妊娠高血糖。 (2)从浙江大学附属妇产科医院分别收集IVF组和对照组脐血管14例以及45例IVF组和48例对照组脐血。入选标准为：产妇的年龄为25-35岁,孕周足月,单胎妊娠、出生体重为大于2500g小于4000g,剖腹产,并且排除各种妊娠并发症和子代出生缺陷。其中3例IVF组和3例对照组的脐静脉用来提取蛋白用于蛋白组学实验。其余用于后面的验证实验(荧光定量PCR和western blotting)和免疫组化实验。利用碘雌二醇放射免疫分析药盒测量了脐血中的雌激素浓度。 (3)体外实验以人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,通过不同浓度的雌激素处理,采用荧光定量PCR技术和western blotting技术检测lumican和vimentin的表达水平。 (4)利用小RNA干扰技术将HUVECs的vimentin干扰后,利用免疫荧光、流式细胞术和transwell方法分别检测细胞的形态、细胞周期和细胞的迁移能力。 3.实验结果： (1)大规模流行病学调查结果显示在3-6岁和6-13岁组中,IVF组的收缩压和舒张压均显著性高于对照组。 (2)应用iTRAQ检测2组脐血管差异蛋白的表达,我们总共鉴定到723个蛋白,其中上调蛋白335个,下调蛋白388个。借助特征分析(Correlation-based Feature Selectim)技术,根据变化倍率至少为+/-1.2倍,最终筛选到了47个差异蛋白,其中20个上调,27个下调。对这47个差异蛋白进行IPA生物信息学分析发现这些差异蛋白与血管系统发育和代谢功能相关。 (3)从蛋白组学结果中筛选了一个上调蛋白lumican和下调蛋白vimentin进行验证。荧光定量PCR和western blotting结果与蛋白组学结果是一致的。(4)IVF组的脐血雌激素浓度是显著高于对照组的。说明IVF子代在胚胎发育过程中受到了高雌激素的刺激,因此高雌激素有可能是引发这些蛋白差异表达的重要原因。 (5)不同浓度的雌激素处理HUVECs后发现,高浓度的雌激素会上调lumican的表达,却抑制vimentin的表达。这一结果和蛋白组学的结果是吻合的。说明我们前面的假设“雌激素是引发IVF子代脐血管蛋白差异表达的重要因素”是正确的。 (6)把HUVECs中的vimentin干扰后,细胞的形态发生了皱缩,细胞周期最阻滞于S期,细胞的迁移能力也受到了抑制,说明该蛋白的表达下调会影响到血管内皮行使正常的生理功能。 4.结论：IVF子代脐静脉血管中存在着与血管系统发育和代谢相关的差异功能蛋白的表达,提示这些蛋白可能是IVF子代发生血管功能紊乱的一个重要原因,另外还发现IVF胚胎发育过程中的宫内高雌激素有可能是这些蛋白差异表达的重要影响因素。这些结果初步筛选了IVF相关脐静脉差异表达蛋白,为深入探讨IVF妊娠过程中的血管异常发育机制,进一步明确IVF与不良妊娠结局和子代健康之间的关系提供了可靠的资料。
【图文】：

学位论文 第谱鉴定及表达差异分析为两组，，IVF组和对照组，各组分别取三例挤静脉进行iTRAQ定及查uniport数据库，共鉴定出723个蛋白（图2.1)，其中根分析），以变化倍率至少为+/-1.2倍作为标准，比值大于1. 2比值小于0. 8为蛋白表达降低，总共{椴槌

本文编号：2659910