蜕皮激素诱导人IGF-Ⅰ在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠模型的建立

发布时间：2020-05-17 16:18

【摘要】：胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一种作用 于多种组织和多种器官的多效性细胞营养因子，早在上个世纪中叶就已经受到 人们的广泛关注。中枢神经系统由于其自身结构的特殊性和复杂性极大地限制 了关于IGF-Ⅰ在该系统内确切的生物学作用及其作用机制的研究。虽然人们围 绕IGF-Ⅰ在中枢神经系统中的生物学作用开展了大量的研究，但较多地采用了 体外分离不同类型的神经细胞来研究IGF-Ⅰ的生物学作用。由于体外分离的细 胞是一种“病态”细胞，本身并不能完全代表它在体内发挥作用时的真实情况。 转基因动物模型以其能够最大限度地模拟体内某种基因发挥作用的真实环境从 而更加容易和准确地探讨该基因的生物学功能及表达调控机制而倍受青睐。 为了能够方便、准确而且真实地研究IGF-Ⅰ在中枢神经系统的发生发育过 程中以及在各种应激、胁迫或疾病条件下所发挥的神经生物学作用及其作用机 制，特别需要建立一个能够在不同的时相下在中枢神经系统特异性即时性表达 人IGF-Ⅰ的转基因小鼠模型，为此开展了下面的研究。 首先，需要得到一个能够指导外源蛋白在中枢神经系统中特异性表达的启 动子。神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)为神 经胶质细胞的主要骨架蛋白，该蛋白的表达主要局限于中枢神经系统的星形胶 质细胞中，，传统上被认为是神经胶质细胞的特异性标志物。由于当时GFAP基 因的调控序列尚属未知，因此需要克隆小鼠GFAP基因的5’端调控区。本研究 采用PCR方法筛选129sv小鼠的基因组文库，经过两轮的PCR筛选和一次噬菌 斑原位杂交，成功地从文库中分离到载有GFAP基因的阳性噬菌体，最终获得 了包括GFAP基因1． 8Kb的5’端调控区和部分编码区在内2353bp的核苷酸序列， 博士学位论文 中文摘要 该段序列已经被GeneBank收录(收录号:AY279974)。经与GeneBank中己有 的GFAP基因序列进行比对，发现不同种属小鼠的GFAP基因存在不同的翻译 起始位点和N端氨基酸序列。 我们利用得到的GFAP基因1 .SKb的5’端调控区构建了中枢神经系统特异 性表达Cre重组酶的转基因载体pGFAp一Cre一hGH。通过显微注射的方法获得了 7只基因组中整合有pGFAp一Cre一hGH的转基因小鼠(命名为:GFAp一Cre)。PCR 和Southem检测都证实7只G刊印一Cre鼠的基因组中的确整合有转入基因。将 G刊企一Cre鼠与ROSA26小鼠进行交配，检测G凡J一Cre鼠中Cre重组酶的表达 J清况。分别选取同时携带有两种基因发育至13d的小鼠胚胎和两周龄小鼠的各 种组织制作切片进行LacZ染色。结果证明只有G刊J一Cre鼠的脑部广泛表达有 活性的Cre重组酶，在间脑的脉络丛区表达尤为集中，具有理想的组织特异性。 我们还构建了包含由LoxP序列锚定的neomycin基因组成的阻断序列、蜕 皮激素诱导表达系统和截短型人IGF一I的表达框在内的受控型蜕皮激素诱导表 达人IGF一I的转基因载体pCE一IGF一I。将pCE一IGF一I转染AMI菌感受态，利 用其中表达的Cre重组酶将LoxP序列锚定的neomycin基因删除，解除对前面 启动子的阻断作用。再将重组后的载体瞬间转染COS7细胞，加入MuristeroneA 进行诱导，经W七 Stem检测证明COS7细胞中成功地表达了人IGF一I，在细胞 水平上证明了该载体的有效性。同样通过显微注射的方法获得6只基因组中整 合有pCE一IGF一I的转基因小鼠(命名为:CE一IGF一I)。pCR和Southem检测都 证实6只CE一IGF一I鼠的基因组中的确整合有转入基因。 将GFAP一Cre鼠与CE一IGF一I鼠进行交配，选取携带有两种基因的子代鼠， 此类鼠即为我们最后的目的鼠一蜕皮激素诱导截短型人IGF一I在中枢神经系统 特异性表达的转基因小鼠模型。利用PCR方法检测证实脑部特异性表达的Cre 重组酶介导了其间LoxP位点间neomycin的删除。利用RT一PCR方法检测证实 删除阻断序列后蜕皮激素诱导表达系统的两个转录激活因子VgEcR和RxR进 行了转录，并且在M丽steroneA诱导后成功地激活了后面表达框内人IGF一I的 转录。选取经MuristeroneA诱导后的转基因鼠脑组织制做切片进行免疫组化染 色。染色结果证明:经MuristeroneA诱导后的转基因鼠的脑部成功表达了人IGF- I，与Cre重组酶的表达模式相似主要集中在间脑的脉络丛区表达。
【图文】：

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本文编号：2668835