嘌呤能受体P2X5和P2X1在小鼠中枢和外周神经系统发育中的表达

发布时间：2020-05-21 11:17

【摘要】：近些年来,众多的研究从分子、细胞和系统水平表明,细胞外ATP通过作用于P2嘌呤能受体在多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。过去的十年,我们对于该类受体在神经系统发育中的功能有了越来越多的认识,研究发现它们在细胞增值、细胞迁移、神经元和胶质细胞的成熟和分化、细胞的死亡和生存中都发挥着一定的作用。 P2嘌呤能受体由两大家族组成：离子通道型P2X家族(P2X1-7)和G蛋白偶联受体P2Y家族(P2Y1,2,4,6,11,12,13,14)。已有一些工作初步研究了大鼠胚胎发育过程中P2X家族和P2Y家族在脑中的表达情况,然而除了P2X3和P2Y1亚型外,对于其他亚型的研究还较少。 P2X5受体存在于多种脊椎动物中。既往的研究发现该类受体主要分布在皮肤、肠道、膀胱、胸腺和脊髓等部位的处于增值状态的细胞中,主要作用是参与抑制细胞增值从而促进细胞分化。神经系统发育过程中涉及大量的细胞增值、细胞分化等生理过程,提示P2X5受体可能参与了此过程。我们的工作首先分析了小鼠出生前的四个时间点(E9、E11、E13、E17)的脑提取物中P2X5受体的mRNA和蛋白的表达情况。利用RT-PCR技术发现在四个时间点均可以在323bp位置检测到明显的条带,表达量也存在明显的变化趋势——从E9到E13逐渐增加,从E13到E17逐渐下降。利用蛋白印迹实验发现,从E9开始在35KD位置均能检测到单一条带,表达量也呈现从E9到E13逐渐增加而从E13到E17逐渐下降的趋势。在小鼠出生前的五个时间点(E8、E9、E11、E13、E17)取材进行免疫组织化学实验发现,在神经管刚刚形成的E8时就可以检测到P2X5的存在,该强烈的阳性信号主要分布在神经上皮层。在E11时,后脑、中脑和前脑区域均发现很强的阳性染色。但随着脑的发育,阳性信号逐渐局限在新生神经元开始分化的皮质板位置。同样在脊髓处,可以发现相似的表达情况。在E9时,阳性信号在整个脊髓区域都可以检测到；但随着发育的进行,阳性信号逐渐局限到腹侧角位置。先前的工作发现P2X5受体在成体哺乳动物中枢神经系统中主要分布在神经元中,因此我们使用神经元的标记物TUJ-1抗体进行免疫双标实验以确定P2X5阳性细胞的类型。在E8时的神经管中,只有极少量(不到5%)的P2X5阳性信号与TUJ-1阳性信号共标,同样在E9时的脊髓中发现了相似的情况。然而,在E11时的皮质板和腹侧角区域,绝大多数P2X5阳性信号与TUJ-1阳性信号共标。在小鼠的背根神经节中,从E9时开始发现P2X5受体均一地表达在DRG神经元中,而且所有的P2X5阳性信号与TUJ-1阳性信号共标。在E11时视网膜的神经细胞层和视神经中均可以检测到P2X5受体的强信号,而且绝大多数的P2X5阳性信号与TUJ-1阳性信号共标。在肠道中,所有的P2X5阳性信号与TUJ-1阳性信号共标。在嗅上皮中也检测到P2X5受体的强信号。另外,很强的P2X5阳性信号也存在于内耳和前肢骨骼肌上散在的神经纤维中。既往的研究发现ATP等激动剂刺激P2X5受体仅能产生极小的电流,但是该受体与P2X1受体形成的异源多聚体P2X1/5却具有对于ATP的高敏感性、不易敏化等特点。为了研究P2X5受体的生理功能,我们首先需要确定在神经系统发育过程中P2X5受体是否可以与P2X1受体形成异源多聚体。我们也利用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学技术等技术研究了P2X1受体在神经系统发育过程(Ell、E14、P0、P21)中的表达,发现该受体从E11时开始表达在神经系统中。这种分布上的重叠现象提示两受体之前存在形成异源多聚体的可能性。进一步利用免疫共沉淀实验发现,P2X1和P2X5可以共沉淀。这些实验提示P2X5受体可能与P2X1受体形成异源多聚体来发挥生理功能。本研究首次报道了神经发育过程中P2X5受体和P2X1受体在中枢和外周神经系统中的表达情况,发现P2X5受体在神经发育的早期阶段一过性的高表达,并逐步局限到新生神经元中,并发现P2X5受体和P2X1受体可能以P2X1/5异源多聚体的形式发挥作用。本工作丰富了对于P2受体各亚型在神经系统发育中时空表达的认识,并为该类受体的功能研究提供了更多的信息。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338

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