大鼠胰腺促性腺激素释放激素及其受体的研究

发布时间：2020-06-16 15:41

【摘要】： 经典理论认为促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种十肽激素，它经下丘脑垂体门脉系统进入垂体前叶，与垂体前叶的促性腺激素分泌细胞上的促性腺激素释放激素受体(GnRHR)结合，刺激卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的分泌，进而调节性腺的发育与配子的形成。近二十年的大量研究证据表明，GnRH及其受体广泛存在于下丘脑-垂体轴之外，如生殖系统(卵巢、输卵管、前列腺、睾丸以及胎盘等)、免疫系统(T、B淋巴细胞)和许多恶性肿瘤(如乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌)，通过自分泌和旁分泌途径对这些组织器官以及恶性肿瘤的生长起调节作用。 我们先前的研究表明，在大鼠的消化系统广泛地存在有GnRH及其受体，并且其受体的基因序列与垂体的基因序列一致，说明大鼠的消化系统能够自身分泌与合成GnRH及其受体，同时这些组织或细胞是GnRH作用的靶细胞，如GnRH类似物可明显促进大鼠 第四军医大学博士学位论文：大鼠胰腺促性腺激素释放激素及其受体的研究 颌下腺神经生长因子的分泌，还可明显抑制大鼠胃酸的分泌。但 是大鼠胰腺是否存在GnRH及其受体，它们的基因序列如何，GnRH 对大鼠胰腺的功能有何影响，其受体的信号转导机制怎样，这些 问题均未见报道。 由此我们在以往研究的基础上。进行了以下研究： 应用兔疫组织化学和原位杂交技术在胰腺组织切片上检测 GnRH及其受体的定位及表达； 利用反转录PCR和基因克隆测序的方法对大鼠胰腺GnRH及其 受体的基因序列进行研究； 运用组织块体外孵育法，用不同浓度GnRH类似物进行刺激， 同时借助ELISA、放免法等技术观察在体外条件下GnRH对大鼠胰 腺内、外分泌功能的影响； 借助活体动物实验，由尾静脉注射和十二指肠灌注两种方式给 与GnRH类似物，留取血浆和十H指肠液，分别检测胰腺内、外分 泌功能指标的变化； 原代培养大鼠胰腺腺泡细胞，体外条件下给予GnRH类似物刺 激，应用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞技术，观察GnRH对大鼠 胰腺细胞凋亡的影响： 用ELISA、放免法、激光共聚焦技术和免疫组化染色技术等观 察不同浓度GnRH类似物在不同时间内对大鼠胰腺细胞胞内cAMP、 MAPK、PKC、Ca卜、iNOS含量变化的影响。 通过实验得到主要研究结果如下： 应用免疫组织化学和原位杂交的方法发现，胰腺的外分泌部 部分细胞含有GnRH免疫反应阳性物质，而胰岛细胞未发现GnRH 免疫反应阳性物质。同时胰岛内所有胰高血糖素免疫反应阳性的 4 第四军医大学博士学位论文：大鼠胰腺促性腺激素释放激素及其受体的研究 细胞均呈GnRH受体免疫反应阳性，两种阳性细胞的数量及分布特 点完全一致。原位杂交杂交结果显示在胰腺内、外分泌部均发现 GnRHR觎NA杂交信号。结合以往研究发现胰腺外分泌部检测到 GnRH mRNA杂交信号，我们认为胰腺外分泌部细胞能够分泌GnRH， 而其受体分布于胰腺内、外分泌部大部分细胞。 我们从大鼠胰腺提取总RNA，应用反转录PCR的方法分别扩 增GnRH和GnRHR基因，并对产物进行纯化回收，然后进行序列分 析，结果发现大鼠胰腺GnRH基因序列与下丘脑的完全一致：而胰 腺GnRHR基因序列与垂体的完全一致。 应用不同浓度的GnRH类似物进行体外组织块孵育，收集培养 上清液进行检测发现，体外条件下，GnRH能明显增加胰蛋白酶和 胰高血糖素的分泌，降低胰岛素的分泌，并且具有明显的浓度依 赖性。 体内动物实验中我们从尾静脉和十二指肠两种途径给药，结 果发现：尾静脉给药能明显增加胰蛋白酶和胰高血糖素的分泌， 降低胰岛素的分泌；十二指肠给药仅能增加胰蛋白酶的分泌，对 胰岛素和胰高血糖素的分泌均无影响。 最后我们对GnRHR的信号转导分子进行了研究，发现GnRH类 似物刺激胰腺细胞后，PKC活性的变化显示明显的时间和剂量依赖 性，其活性高峰出现在30min；cAMP水平变化里时间和剂量依赖 性，在个2小时含量变化最大，2小时达高峰：瞅瞅在短时间内 即出现活性高峰，且其含量变化里剂量依赖性；i NOS的活性在整 个实验过程中没有出现明显的变化；同时本实验观察＊”变化曲 线时可以看到延迟峰（膜上钙通道开放所致）和瞬时峰（胞内钙 库开放所致）均存在，推测胞内＊“水平的提高有胞内和胞外两 5 第四军医大学博士学位论文：大鼠胰腺促性腺激素释放激素及其受体的研究 种来源的＊”的参与，分别应用膜上二型钙通道阻滞剂Lac i di…ne 和胞内钙库阻滞剂Ryanodine的实验进一步证明这一推测，即胞 内C／“水平的提高既有通过膜上乙型钙通道进入胞浆的＊“也有 通过胞内钙库释放进人跑浆的CaZ”的参与。由以上结果我们推测 大鼠胰腺GnRHR的信号转导有叫C－Cd”途径，同时还有cA惭、MAPK 的参与。 综上所述，本研究首次在大鼠胰腺中发
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329
【图文】：

纯出一种哺乳类GnRH(mGnRH)以来，人们又陆续发现了羊、大鼠、小鼠等哺乳类动物的mGnRH，并且发现其在分子结构上具有高度的保守性(图1)。在King和Millar(1979)于非哺乳类脊椎动物脑中发现新的GnRH分子类型以前，人们一直认为GnRH的分子形式只有一种。在对非哺乳类脊椎动物的研究中，人们陆续发现了一些新的GnRH分子，它们长度相同，是由九种不同类型的氨基酸组成的十肤，含至少50%相同的氨基酸序列，结构上它们的一COOH端和一NHZ端(第1，2，3

图520一25Kb，GnRHR基因和转录单位结构示意图。GnRHR单拷贝基因长约由3个外显子和2个内含子构成，各种属间高源性较高。2.GnRHR的垂体外表达及调控研究表明，垂体组织中GnRHRmRNA的含量最高，其次为卵巢和翠丸，分别为40%和5%(Stojilkovie等，1994);近来人们采用RNA印记、RT一PCR、原位杂交和受体结合试验分析表明，在大鼠、牛、羊和人等哺乳类动物的垂体中存在的GnRH自分泌调节机制。随着研究的深入，人们发现除下丘脑一垂体轴系以外，GnR!1及其受体均可存在于其它组织器官中。在生殖系统，经RT一PCR及克隆测序等研究发现，GnRH及其受体存在于卵巢上皮细胞(Kang等，、en，;atwan，

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 黄威权，向正华，孟琳;促性腺激素释放激素mRNA阳性细胞在大鼠胃肠胰系统的分布[J];解剖学报;1996年02期

本文编号：2716231