脐带间充质干细胞临床前安全性研究

发布时间：2020-06-19 15:41

【摘要】：间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能,已被广泛应用于再生医学、自身免疫性疾病的临床研究之中。和造血干细胞等其他干细胞不同,MSCs是一类在体外易于扩增的干细胞。因此,虽然MSCs在体内含量极少,但可以通过体外扩增制备大量的MSCs,以满足临床使用的需要。虽然许多研究结果显示,体外扩增的MSCs用于临床试验时未见明显的毒副作用,但是我们目前对MSCs的生物学特性了解还不是十分清楚,制备供临床使用的MSCs的体外操作过程是否会对MSCs产生不利的影响也还未有定论。目前还不能说MSCs就是一种安全的细胞治疗产品,许多MSCs临床应用相关的安全性问题还值得我们去探索。对于体外扩增是否会影响MSCs的生物学特性,是否会影响其临床使用的安全性等问题,还缺少系统而全面的研究。本研究以人脐带MSCs (human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUC-MSCs)为研究对象,研究体外长期传代对hUC-MSCs生物学特性,包括分化潜能、致瘤性、基因组稳定性等的影响,并在食蟹猴中对体外传代的hUC-MSCs进行了体内的长期毒性分析,为评价体外扩增的hUC-MSCs作为临床使用的安全性提供必要的实验证据。文章将分为三个部分：第一部分,体外长期传代对hUC-MSCs生物学特性的影响我们对多个不同个体来源的hUC-MSCs在体外进行了长期传代培养,所有样本均未在体外培养过程中表现出无限的增殖能力,也未发现任何恶性转化的迹象。体外长期培养的hUC-MSCs陆续停止了分裂增殖,并出现衰老的特征。在体外进行了30个代次的传代培养之后,hUC-MSCs仍然保持了其基本的细胞表面分子标记和多向分化潜能。在本研究所涉及的低代次的hUC-MSCs中,都能检测到hTERT的表达,其表达水平在体外培养过程中未有升高,而是逐渐降低,甚至消失。不论其是否在体外长期培养过程中一直存在hTERT的表达,hUC-MSCs的平均端粒长度在体外传代过程中不断缩短。hUC-MSCs中较低的hTERT表达,不足以维持其在分裂增殖过程中的端粒长度。在体外长期传代培养过程中,hUC-MSCs出现染色体数目突变的可能性存在,但是较小。然而,体外培养的hUC-MSCs普遍会出现拷贝数的变异(Copy Number Variation, CNV)。不同个体来源的hUC-MSCs出现CNV的频率相差较大。通过对高低代次hUC-MSCs转录组的研究分析,我们发现,基因组稳定的hUC-MSCs和基因组不稳定的hUC-MSCs在转录组水平存在着较大的差异。一些与DNA损伤反应、错配修复、染色体稳定性维持的相关信号通路,在基因组稳定的hUC-MSCs和基因组不稳定的hUC-MSCs勺体外长期传代过程中,表现出完全相反的变化趋势。我们的研究结果为定期检测体外培养的MSCs的基因组稳定性及其相关基因的表达水平提供了必要的理论依据,也为筛选基因组的稳定的hUC-MSCs进行临床实验提供了新的方法。第二部分,hUC-MSCs在无血清培养基中的长期传代培养虽然从安全性和质量、过程的可控性等方面讲,无血清培养体系是制备供临床使用的hUC-MSCs的最理想的培养方案。但是,之前的研究往往集中于如何在无血清培养基中提高MSCs的贴壁和增殖能力,而对其基因组稳定性、转录组变化情况等临床使用安全性相关的问题研究得还比较有限。因此,我们建立了无血清、无动物源成分、无人源成分、化学成分完全清晰的hUC-MSCs培养体系,并对在该体系中长期培养的hUC-MSCs进行细胞表面分子标记、hTERT的表达、转录组和基因组稳定性等生物学特性的分析,并和传统有血清培养基中培养的hUC-MSCs进行了比较。我们的研究结果发现在无血清培养基中,hUC-MSCs分裂增殖得更慢,在经过长期培养后逐渐出现了衰老的特征并停止生长,其hTERT表达也迅速消失。但是无血清培养基中培养的hUC-MSCs的细胞表面标志物的表达情况仍然保持了和传统有血清培养基中培养的hUC-MSCs基本一致,也具有分化成脂肪、骨、软骨的多向分化潜能。与有血清培养基中的情况一样,无血清培养基中培养的hUC-MSCs也会发生CNV的变异。无血清和有血清中培养的hUC-MSCs最大的差异是转录组的不同。许多和细胞周期和增殖相关的基因在无血清培养基来源的hUC-MSCs中有较大的变化。在无血清培养基中培养的hUC-MSCs中,未发现原癌基因表达水平异常升高等恶性转化相关的迹象。第三部分,hUC-MSCs反复静脉滴注给予食蟹猴6周的毒性试验为了观察hUC-MSCs反复静脉滴注给予食蟹猴的毒性反应以及hUC-MSCs在其体内的定植分化情况,为其临床研究提供动物试验资料,我们在食蟹猴体内对hUC-MSCs进行了反复静脉滴注的毒性实验。试验选用32只食蟹猴,雌雄各半。后肢静脉滴注给药,每2周给药1次,连续给药4次,共6周。试验期间进行了临床观察、体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、T淋巴细胞亚群(CD3、CD4和CD8)、淋巴细胞增殖能力、细胞因子(IFN-γ、IL-4)、抗体、骨髓涂片等指标的检查。动物安乐死后进行大体解剖、主要脏器称重,并对40多种组织器官进行病理组织学检查。同时进行了毒代动力学,以及hUC-MSCs在动物体内的定植和分布的研究。结果显示,试验期间各给药组动物的体重、体温、心电图指标、血液生化指标、骨髓涂片、尿常规、眼科检查、脏器重量均未见有毒理学意义的规律性改变。可能的毒性反应为呕吐,RBC、HGB和HCT降低,APTT延长,hUC-MSCsP13高剂量组1只动物肺组织见陈旧性肺出血和间质性肺炎以及肝脏小胆管周围炎的表现,不确定与药物相关性。hUC-MSCs反复静脉滴注,对注射部位的血管无明显的刺激性损伤作用。整个试验过程中,未见明显的排异反应,未见明显的肿瘤发生；个别动物中检测到免疫学细胞因子认为没有重要的毒理学意义；不同代次的hUC-MSCs与其可能的毒性反应无明显相关性。hUC-MSCs反复静脉滴注给予食蟹猴,免疫原性较弱,未检查出针对完整细胞的抗体形成。末次药后次日, hUC-MSCs P7低剂量组1只动物的心脏、脑,hUC-MSCs P7高剂量组1只动物的肝脏,hUC-MSCs P13高剂量组1只动物心脏,1只动物的肺、股四头肌、骨髓均可检测到hUC-MSCs,但免疫组化未检出US-MSC在这些组织中定植分化。停药2周及6周后,各组动物各组织中均未检测到hUC-MSCs分布。综上所述,在本试验条件下,hUC-MSCs反复静脉滴注给予食蟹猴的安全剂量为1.0×107细胞/公斤,该剂量是临床拟用剂量的10-20倍。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

【参考文献】