VSTM1-V2在炎症反应调节中的功能研究

发布时间：2020-08-04 05:26

【摘要】：机体固有免疫系统在宿主防御中发挥重要作用，中性粒细胞和单核/巨噬细胞是固有免疫系统中最重要的效应细胞。机体感染后他们立即激活并募集到感染部位，识别、吞噬和清除入侵病原体，同时分泌促炎介质，募集其他免疫细胞到达感染部位，激活机体适应性免疫系统。但是在清除病原体同时，也可能因免疫反应过度，导致严重的组织损伤，甚至引起致死性败血症休克，导致宿主死亡。免疫系统依靠多重机制调节这些过量激活的免疫反应，其中一个重要的机制是免疫细胞自身表达抑制性受体，抑制自身活性，平衡免疫反应。抑制性受体是免疫细胞上广泛存在的一类免疫反应负向调节器，这些受体与相应配体结合后，经由受体胞浆内尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs, ITIMs）向细胞转导抑制性信号，抑制细胞活性或提高细胞激活的阈值。这些抑制性受体在细胞吞噬、迁移、凋亡以及细胞因子产生等多方面调节免疫细胞活性，控制免疫应答。人类基因组中有300多个潜在的能够编码ITIMs的基因，其编码分子可能参与免疫细胞调控，但目前功能明确的只有1/5，大多数基因及其编码分子的功能仍不清楚，V组跨膜结构域包含物1（V-set and transmembrane domain containing1, VSTM1）正是其中之一。目前关于VSTM1的功能报道很少。对其表达谱和DNA序列分析发现，VSTM1至少存在5种剪切体，VSTM1-V1～V5，其中VSTM1-V1和VSTM1-V2是主要表达形式。VSTM1-V1在正常组织和细胞中广谱表达，VSTM1-V2主要表达于免疫系统。VSTM1-V1为Ⅰ型膜蛋白，也称为白细胞信号抑制性受体-1（signal inhibitoryreceptor on leukocytes-1, SIRL-1），主要表达于人中性粒细胞和单核细胞上，其胞浆内尾部带有ITIMs，因此是一个潜在的天然免疫反应的抑制性受体，VSTM1-V2为经典分泌的糖蛋白，除了没有跨膜结构外，与VSTM1-V1序列完全一致，二者配体结合结构域完全一致，因此考虑VSTM1-V2与VSTM1-V1可能竞争结合配体。研究发现VSTM1-V1对巨噬细胞功能有抑制作用，而VSTM1-V2蛋白能促进外周血CD4+T细胞分泌IL-17A，也能促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化，而且在某些类风湿性关节炎患者血清中表达水平明显升高，因此可能与自身免疫病的发生和发展密切相关。目前对VSTM1-V2的研究是在适应性免疫调节方面，VSTM1-V2对固有免疫调节作用仍然未知。【目的】通过体外炎症相关细胞培养以及急性炎症小鼠模型建立，研究VSTM1-V2在机体固有免疫尤其是抗病原体感染免疫中发挥的调节作用。【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）和人单核细胞系THP-1细胞，以细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）或肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF）-α作为阳性刺激物激活培养细胞。细胞分为正常对照（PBS）组、阳性刺激（TNF-α/LPS）组、不同浓度蛋白（VSTM1-V2）处理组、刺激物+不同浓度蛋白（TNF-α/LPS+VSTM1-V2）刺激组。MTT实验检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞增殖的影响；划痕实验检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs迁移的影响；测定细胞培养上清MPO活性和NO水平，明确VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞活性的影响；RT-PCR检测VSTM1-V1和VSTM1-V2基因在HUVECs中的转录情况以及VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞的促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）、趋化因子（IL-8、MCP-1、CXCL2等）以及细胞表面黏附分子（VCAM-1）的转录水平的影响；ELISA方法检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞培养上清中炎症介质表达和分泌的影响；Western bloting方法检测VSTM1-V2蛋白对HUVECs或THP-1细胞表达黏附分子（VCAM-1）、炎症因子（IL-6）以及细胞内信号分子JNK1和转录因子NF-κB（P65）的蛋白水平的表达，探讨VSTM1-V2可能的细胞内作用机制。以肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae, Kp）气管内注射方法建立小鼠急性肺炎模型，尾静脉给予VSTM1-V2蛋白，实验小鼠分为正常（Normal）组、Kp组和Kp+VSTM1-V2组，设6h和12h两个时间点，在不同时间点采血、分离肺组织，HE染色观察VSTM1-V2蛋白对急性肺炎的影响，肺组织提取总RNA，real-time qPCR方法检测细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2）表达，肺组织匀浆检测MPO及iNOS活性；流式细胞术微球阵列法检测VSTM1-V2蛋白对血清细胞因子（TNF-α、IL-6、MCP-1、和IL-10）的影响。【结果】（1）HUVECs中有VSTM1-V1和VSTM1-V2表达，但表达量很低；TNF-α作用后VSTM1-V2表达相对VSTM1-V1增加，可能降低了由VSTM1-V1维持的细胞活化阈值，有利于细胞活化；VSTM1-V2刺激细胞后，VSTM1-V1相对VSTM1-V2增加更明显，细胞可能因活化阈值升高，活性被抑制；VSTM1-V2预处理后，再用TNF-α刺激，发现TNF-α刺激并没有明显改变VSTM1-V1和VSTM1-V2基因转录水平的比例；（2）HUVECs染色结果显示VSTM1-V2作用24h后，细胞数量明显少于PBS对照组，VSTM1-V2处理HUVECs48h后的MTT结果也显示，VSTM1-V2对HUVECs的生长有明显的抑制作用；（3）利用划痕实验检测VSTM1-V2对HUVECs迁移影响，结果显示与TNF-α单独作用组相比，VSTM1-V2与TNF-α联合作用24h后，对TNF-α诱导的HUVECs迁移有明显抑制作用，VSTM1-V2单独作用对HUVECs也有抑制作用；利用RT-PCR和Westernblotting方法检测HUVECs上黏附分子VCAM-1的表达，发现TNF-α可以促进HUVECs的表达，但这种作用被VSTM1-V2抑制；（4）RT-PCR检测IL-6、MCP-1、IL-8和CXCL2的mRNA表达，结果显示给予TNF-α刺激后，HUVECs表达的促炎因子和趋化因子mRNA水平均升高，但VSTM1-V2可以降低TNF-α诱导的HUVECs趋化因子的产生，但对促炎因子IL-6作用不明显；ELISA检测也发现，TNF-α作用后趋化因子CXCL2表达增加，但可以被VSTM1-V2抑制，Westernblotting检测IL-6的表达也有相同的表现；（5）检测VSTM1-V2作用后的HUVECs的NO产生，结果显示，VSTM1-V2与TNF-α共刺激HUVECs后，增加了NO的产生，提示VSTM1-V2对HUVECs的NO产生有影响；（6）Western blotting方法检测VSTM1-V2作用后HUVECs内NF-κB（P65）和MAPK8（JNK1）表达变化，结果表明TNF-α诱导后P65和JNK1的增加都被VSTM1-V2所抑制，提示VSTM1-V2对TNF-α诱导的HUVECs活化的抑制作用，与NF-κB或MAPK信号转导途径相关，可能通过抑制转录因子P65和信号调节分子JNK1对HUVECs进行调节；（7）小鼠Kp急性肺炎模型中，HE染色后发现，VSTM1-V2对小鼠急性肺损伤有减轻或抑制作用；肺组织匀浆后，检测MPO和iNOS活性，结果显示给予VSTM1-V2蛋白组小鼠肺组织MPO和iNOS活性都低于模型组小鼠，提示急性肺损伤模型小鼠肺组织有中性粒细胞浸润且活性增强，而VSTM1-V2可以减弱这种损伤作用；（8）Real-time qPCR检测肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2的mRNA的转录水平，结果显示，Kp组各种炎症因子表达水平远远高于正常组，而VSTM1-V2+Kp组与Kp组相比，各种炎症因子表达都明显降低（P＜0.01），结果提示VSTM1-v2对急性肺损伤小鼠肺组织各种炎症因子有抑制作用；（9）流式细胞术微球阵列法检测VSTM1-V2蛋白对血清细胞因子的影响，结果显示与Kp组相比，VSTM1-V2+Kp组TNF-α、IL-6和MCP-1的各个时间点表达均降低（P＜0.05），而IL-10各个时间点的表达均高于Kp组（P＜0.05），结果提示Kp感染小鼠后，促炎细胞因子表达均升高，VSTM1-V2抑制了这些炎症介质的分泌；（10）但是VSTM1-V2对THP-1细胞的功能研究发现相反的作用，VSTM1-V2不仅对THP-1细胞聚集或相互黏附以及增殖发挥促进作用，而且也能促进LPS对THP-1细胞的活化作用；此外对THP-1的MPO活性测定也发现，VSTM1-V2促进THP-1细胞的MPO活性，而且随VSTM1-V2浓度的升高和时间的延长，THP-1的MPO活性增加，且上述作用可能与提高THP-1细胞内转录因子NF-κB（P65）水平相关。【结论】（1）HUVECs上有VSTM1基因表达，TNF-α刺激HUVECs可以提高细胞VSTM1-V2基因转录，降低细胞活化阈值，促进HUVECs活化；VSTM1-V2可以提高HUVECs的VSTM1-V1基因转录，提高细胞活化阈值，抑制HUVECs活化；（2）VSTM1-V2对体外培养的HUVECs增殖有抑制作用，也对TNF-α诱导的HUVECs迁移、黏附分子表达及细胞因子产生有抑制作用；VSTM1-V2抑制TNF-α诱导的HUVECs激活作用与细胞内信号分子JNK1和转录因子NF-κB（P65）下调有相关性；（3）VSTM1-V2对小鼠Kp模型的免疫损伤有保护作用，可以抑制克雷伯杆菌引发的肺组织损伤和促炎因子的分泌；（4）VSTM1-V2对体外培养的THP-1细胞有促进作用，不仅直接促进THP-1的增殖、聚集及MPO活性增加，也能促进LPS诱导的活化作用，VSTM1-V2对HUVECs和THP-1细胞不同的作用，可能与不同细胞上VSTM1基因表达水平、配体分布水平及影响的信号转导通路不同有关。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363

【共引文献】