日本血吸虫（中国大陆株）特异性IgE抗体相关抗原和表位的筛选与鉴定

发布时间：2020-08-11 21:53

【摘要】： 当前，血吸虫病仍然是严重危害人类健康和生命的主要寄生虫病种。在防治策略上，以吡喹酮化疗为主，结合药物灭螺、有螺环境改造和健康教育的综合性防治措施取得明显效果。但在广大的江湖洲滩地区，因环境复杂，灭螺成本高，人畜活动频繁，控制血吸虫病的传播上缺乏十分有效的手段。加之流行区血吸虫再感染的反复发生，现行的控制措施明显不能满足防治形势的需要，迫切要求新的措施介入。因此，血吸虫病疫苗研究及可为疫苗研究提供有益线索的血吸虫感染免疫和免疫病理机制的研究，备受关注。在对血吸虫感染免疫和免疫病理机制获得不断深入认识的基础上，继续寻找新的具免疫保扩作用的疫苗候选分子，是血吸虫病疫苗研究工作的重要内容。大量的血清流行病学资料和实验室研究的证据表明，血吸虫特异性IgE抗体在抗血吸虫感染免疫中发挥重要作用。在此基础上提出的发展以诱导特异性IgE抗体应答的血吸虫病疫苗的研究策略，具有充分的现实可行性。为此，本研究首先从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和克隆血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白编码基因，再亚克隆入表达质粒载体并实现原核表达。接着通过生物信息学分析，获得核苷酸及其编码蛋白的组成、结构和同源性的相应资料。进一步对纯化的原核表达蛋南京医科大学博士学位论文蛋白的免疫原性、诱导机体免疫应答的特征及其在抗血吸虫攻击感染中的免疫保护作用和对肝虫卵肉芽肿形成和肝纤维化的影响，以及诱导产生的特异性抗体在体外通过AmC效应的杀血吸虫童虫机制等方面进行试验和观察，并结合该蛋白分子在血吸虫体内的分布特征，以综合评价其在抗血吸虫感染免疫中的作用和意义。本研究还对日本血吸虫特异性 IgE抗体相关肽表位诱导免士疫应答的特征及在抗血吸虫感染保护性免疫中的作用，进行了初步的试验观察。研究内客包括以下方面：一．日本血吸虫特异性 IgE抗体相关抗原编码基因的克隆 ABC斗L SA法从日本血吸虫病流行区居民中筛选具高水平抗日本血吸虫成虫抗原 IgE抗体的个体，采血并分离血清。将混合血清用Proteil。G柱吸。1丈以去除乃G型干扰抗体后，用于日本血吸虫成虫 CDNA文库的免疫学筛选；用羊抗人 IgE抗体二抗以保证筛选获得乃非抗体的特异性克隆。F巳性克隆插入片段经KR扩增，用于nA序歹。J测定。jNIJ序结果显示，该插入片段为1200 hP，第一开读框长507 hP，编码169个氨基酸残基，理论分子量为19．3 kDI。该M八序列与已知血吸虫基固序列相寸性小于4 0％，初步提示为新的日本血吸虫蛋白编码序列，命名为Sj43B。于插入片段两侧重新设计引物并 5］入 ECOR和 NO ti位点，将其先克隆入 PGME丁载体；重复测序结果与KR产物测序相同，再亚克隆入表达载体构建重组质粒Sj扔B冲GEX乃P十。n IPTG诱导表达，产物沉淀中于约45 kDa处显见高合蛋白表达带，Western blot分析表明，该蛋白带可被筛库血清中特异性lgE抗体识别；而载体本身表达的26 GST蛋白带则否。表明通过免疫学筛选和基因重组表达，获得了血吸虫特异性 IgE抗体相关蛋白。借助现行生物信息学分析手段，通过互联网进入GenBank数据库，对Sj43B与已知序列进行同源性比对，应用 DNAtOOIS软件对其编码蛋白序列的氨基酸纽成、亲水性、抗原性和可及性进行分析，并在 blastp程序下在 GenBank蛋白数据库中对 Sj43B编码－3－人卞医科大学博士学杠论文蛋白进行同源性检索。结果显示，Sj43B基因核菩酸序列与己知序歹J的 Scores分值均。J、＋ 200，提示 Sj43B为一新的蛋白编码序列。该基因编码蛋白的等电点是5．89，其亲水性、抗原性和可及性分布曲线基本一致，预测抗原表位分另IJ在第 2 5－3 5位、7 5－8 2 位、1H－1们位、117－1n位和 149－159位氨基酸残基。蛋白同源性分析显示，Sj43B编码蛋白与来自人和＊、鼠的含洲3结构 ‘域蛋白的同源性为3洲。这一结果对提示该蛋白可能的功能作用，具有重要的参考价值。 H．Sj43B／PGEX－6P－1重组质粒的诱导表达、表达产物的乡寸和免疫学性质鉴定分析为获得可溶性的 rsj43B月6 GST A虫合蛋白，对不同 IPTG诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间等因素对融合蛋白可溶性表达的影响进行了观察。结果显示，在 k 05 flllllO UL一 2．0 mmo UL 的IPTG浓度、15C－37C诱导表达温度和lh－4 11诱导表达时间范围内，改变相应条件对重组蛋白的可溶性表
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392
【图文】：

酶切鉴定,重组质粒,表达载体,质粒重组

的鉴定选择性培养获得的白斑中提酶切后，电泳显示一约55，表明pGME一T质粒重组成功一1的鉴定Notl双酶切表达载体pGEX应后的转化大肠杆菌BL21Notl双酶切出约550bP隆入表达载体pGEX一6p一1。bP1234

载体表达,标志物,聚丙烯,质粒

沉淀中于约45kDa处有一特征性高表达融合蛋白条带，含空载质粒的对照菌则表达载体本身的日本血吸虫26kDaGsT蛋白(图4)，而重组菌裂解物的上清中则无此融合蛋白条带，提示重组基因表达产物可能是以不溶性包涵体形式存在。we5ternbl。t结果显示，重组菌于45kDa处的表达条带，可被筛库血清中血吸虫特异性工gE杭体识别，正常人血清对其不识别。空载质粒的对照菌表达的26kDaGST条带，不被特异性IgE抗体识别。见图5。123kDa融合蛋白fUSioflProtein图4表达产物的聚丙烯酞胺凝胶电泳1重组质粒载体表达菌2蛋白标志物3空载质粒/宿主菌丑coj，’BLZIF19.Lane4SDS一PAGEoftheexPressedProductsofeloneSj43BPlasmidPlasmidLane2Protein

重组表达,质粒载体,标志物,蛋白

5.表达产物的we5ternbl。t鉴定重组表达菌2蛋白标志物3质粒载体4空载19.5WesternblotanalysisoftheexPresanel丑co/jBL21withrecombinantPlasmidLane3及colj/PGEX一6P一1Lane4E.cojjBL21w

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