人未成熟和成熟NK细胞的分子特征及其转录调控网络

发布时间：2020-08-12 02:29

【摘要】：自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells)是固有免疫系统中最重要的组成部分,也参与适应性免疫应答。NK细胞通过释放细胞因子、趋化因子和细胞毒活性等方式在抵抗病毒和其他病原体感染早期以及杀伤肿瘤细胞中发挥关键作用。人的NK细胞由CD34+造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)发育而来,HSCs主要存在于骨髓中；脐血、外周血、胸腺、二级淋巴器官、肝脏以及蜕膜组织来源的HSCs在体外实验中也可以诱导出NK细胞,这表明NK细胞的终端分化不仅仅存在于骨髓中。NK细胞的发育成熟需要经过一系列有序的阶段,但我们对未成熟和成熟NK细胞的分子特征及转录调控知之甚少。目前,关于小鼠NK细胞研究报道较多,而对人NK细胞的全面理解尚未实现。在人外周血中,NK细胞约占淋巴细胞总数的10%,在这些外周血NK细胞(peripheral NK, pNK)中有约95%为CD56dimCD16+成熟的NK细胞；与此不同的是,NK细胞是正常妊娠期间蜕膜组织中占主导地位的淋巴细胞(约占淋巴细胞总数的70%),这些早孕蜕膜NK(decidual NK, dNK)细胞主要为CD56brightCD16-未成熟的NK细胞。为了进一步确认pNK细胞相对于dNK细胞更为成熟,我们分析了转录因子T-bet和ID2的表达。转录因子T-bet在最后阶段调节小鼠NK细胞的终端成熟和功能；ID2表达于NK细胞的祖细胞,并调节其早期发育过程。有趣的是,我们发现,dNK细胞多为T-bet-,而90%的pNK细胞呈现T-bet+的表型。免疫印迹分析表明,ID2在dNK细胞中的表达量高于pNK细胞。此外,我们还检测了许多已报道的与NK细胞发育、成熟相关的标志分子的表达,与预想结果一致,我们发现dNK细胞高表达许多不成熟的标志分子(如CD27和CD94),而pNK细胞则高表达许多成熟的标志分子(如CD57和CDllb)。综上,我们的这些结果表明,dNK细胞相对于pNK细胞表现出相对未成熟的特征。为了更好的发现人的未成熟和成熟NK细胞的新的分子特征以及其转录调节因子,我们以外周血CD56+T细胞和CD3+CD56-T细胞作为对照,对纯化的dNK、脐血NK(cord-blood NK cell, cNK)和pNK细胞进行了全基因组表达谱分析。通过高通量芯片以及荧光定量PCR和流式细胞术验证的数据,我们对未成熟的早孕蜕膜NK (immature decidual NK, idNK,表型为CD56brightCD16-T-bet-)和相对成熟的外周血NK(mature peripheral NK, mpNK,表型为CD56dimCD16+T-bet+)细胞做了全面的比较分析。我们不仅研究了未成熟NK和成熟NK细胞之间的差异,还分析了NK细胞相对于T细胞所共有的分子。首先,我们比较了idNK和mpNK细胞表面分子表达的差异,我们发现这些差异与它们各自的已知功能是一致的。idNK细胞表达更多的抑制性受体(例如NKG2A、CD158b和GITR),可能与它们的较弱的细胞毒活性和维持自身耐受相关；而mpNK细胞表达多种活化性受体和共刺激因子(例如CD2、CD8和CD226),可能与它们对病原体感染的细胞和肿瘤细胞的强细胞毒活性相关。其次,我们分析了生长因子、细胞因子、趋化因子以及这些分子的受体在idNK和mpNK细胞的表达水平的异同。我们发现,NK细胞可以分泌骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)、Jagged2和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)等多种生长因子,而这些分子已经被报道可以影响NK细胞的发育,这就说明这些分子除了以旁分泌的方式发挥作用外还可能以自分泌的方式影响NK细胞的发育或功能。此外,值得注意的是,我们发现,与mpNK细胞相比,idNK细胞表达很高水平的与破骨细胞和成骨细胞发生密切相关的生长因子(例如Tnfsf11、Tnfrsfllb、Spp1和Bmp2)。再次,我们发现,idNK细胞内很多趋化因子的mRNA (例如Xcll、Cxcll、 Cxcl10和Cxcl14)表达水平较高,这赋予idNK细胞更强的招募NK细胞自身或其他淋巴细胞的能力,例如招募未成熟的树突状细胞(dendritic cell, DC)和中性粒细胞等。与idNK细胞富含趋化因子基因不同,mpNK细胞相对高表达多种趋化因子受体(例如CXCR4、CXCR2、CXCR1和CCR6),这表明mpNK细胞可能比idNK细胞具有更强的迁移能力。紧接着,我们分析了不同NK细胞亚群的转录因子表达谱。我们的研究描述了人类不同的NK细胞亚群的转录因子,这些NK细胞亚群包括未成熟的NK细胞(dNK和CD56brightpNK细胞)和相对成熟的NK细胞(CD56dimpNK和CD34+HSCs体外诱导的NK细胞)。我们发现,idNK和mpNK细胞分别富含同源异形框家族的转录因子(例如Hoxa5、Hoxa9、Pbx1和Hop)和锌指蛋白家族的转录因子(例如Klf9、Znf143、Znf483和Znf831)。我们推测idNK细胞高表达的同源异形框家族的转录因子可能有助于维持其不成熟的细胞状态,而mpNK细胞高表达的锌指蛋白可能对其细胞毒活性非常重要。此外,通过与T细胞的比较分析,我们发现了许多新的可能调节NK细胞发育或功能的转录因子。迄今,小鼠NK细胞的转录因子相对明确,我们的研究发现许多小鼠模型发现的转录因子同样也表达在人类的NK细胞中(例如Id2、Nfil3、Eomes、Mitf和Klf4)。除了确认了上述小鼠中已知的转录因子,我们还发现了许多新的转录因子可能参与调节NK细胞的发育和功能(例如Etv5、Nfe2、Mycn、Nr2f2和Hoxa10)。最后,根据我们的研究数据,并结合已有的报道以及生物信息学的分析结果,我们对针对性选择的转录因子的靶基因进行了预测,并提出了一个NK细胞的自我调控网络。我们推断,造血干细胞发育过程中,NK细胞自分泌和/或旁分泌细胞因子和趋化因子诱导或激活了转录因子,反过来,转录因子又可以激活或促进对NK细胞发育和成熟至关重要的分子的表达。这可能是成熟的具有功能的NK细胞产生的潜在机制。此外,我们强调自分泌的BMP2和TGF-β2和它们所调节的细胞因子(如骨保护素/OPG,骨桥蛋白/OPN和多效生长因子/PTN)以及idNK细胞中富含的转录因子(如同源盒家族转录因子、CREB和MYCN)相互协调,相互作用,可能有助于维持idNK细胞的不成熟状态。我们的研究的创新之处和意义主要在于： (1)我们发现了一些新的idNK细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子,这些分子可能以自分泌的方式在NK细胞发育的早期及维持其不成熟的状态中发挥重要作用。有趣的是,这些生长因子包括6个(如护骨素和多效生长因子等)对骨形成和发育非常重要的分子,我们将NK细胞的功能拓展到一个全新的领域。 (2)我们首次描述了人的未成熟和成熟NK细胞的转录因子谱。我们发现,未成熟的蜕膜NK细胞富含同源异型盒家族的转录因子,可能有助于维持其不成熟的状态；成熟的外周血NK细胞富含锌指蛋白家族的转录因子,可能有助于发挥其细胞毒活性。 (3)NK细胞自分泌的生长因子、细胞因子、趋化因子和其表达的转录因子相互作用,形成一个复杂的调控网络。我们的研究较为全面的描述了NK细胞的自我调控网络。 (4)通过与T细胞综合比较分析,我们发现了许多新的可能参与调控NK细胞发育、分化或功能转录因子。总体而言,我们的研究从细胞发育和分化的角度对未成熟和成熟NK细胞进行了描述。我们较为详细的分析了人NK细胞的表面受体、生长因子、细胞因子、趋化因子以及转录因子等分子特征并预测了NK细胞的自我调控网络。我们发现的新的转录因子和其下游靶基因可以让人们更好地了解NK细胞的发育及其转录调控网络,有助于控制NK细胞数量和功能,使其更好的应用到临床治疗中。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【共引文献】