CCK-8抗炎作用的受体及cAMP-PKA信号转导机制研究

发布时间：2020-08-12 10:43

【摘要】：炎症反应是机体对抗外来致病因素侵袭的保护性应激反应。但若过分强烈，则体内的炎症细胞被过度激活，持续大量地表达、产生和释放多种促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，这些促炎因子又以“自分泌”或“旁分泌”的方式诱生多种炎症介质的分泌，由此激发炎症连锁反应，以致失去控制，形成全身炎症反应综合征（SIRS），并进而发展为多器官功能障碍综合征（MODS）。 感染性因素和非感染性因素均可刺激宿主炎症细胞，产生大量细胞因子和炎症介质。其中，G-菌菌壁的主要活性成分脂多糖（LPS）是诱导巨噬细胞产生和释放炎症介质最强烈、最有效的激活物，在G-菌感染和内毒素休克发病中发挥重要作用。 在SIRS和MODS的发病过程中，肺脏是公认的最易受损的靶器官。同时也是MODS重要的动力器官，因为肺是炎症细胞激活和聚积的重要场所，它可诱发或加重局部和全身炎症反应，介导组织损伤，促进SIRS的发生和发展。巨噬细胞是体内产生和释放多种炎症介质、诱导炎症反应的关键效应细胞。肺巨噬细胞包括肺泡巨噬细胞（AMs）、肺间质巨噬细胞（PIMs）、肺血管内巨噬细胞、胸膜巨噬细胞、血管壁巨噬细胞、支气管壁巨噬细胞和树突状细胞，其中，PIMs在炎症反应中的作用日益受到人们的关注。与AMs一样，PIMs也具有吞噬能力和释放各种炎症介质的功能，尤其具有较强的分泌IL-1、IL-6的能力；在内毒素血症时，PIMs较AMs受到LPS攻击更早，且其吞噬功能、对补体的趋化作用以及产生氧自由基的能力明显强于AMs，在肺组织的炎症反应中发挥着重要作用。 胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是一种典型的脑肠肽，它不但具有胃肠激素的功能，还以神经递质和神经调质的形式发挥着重要的作用。近年的研究表明，八肽胆囊收缩素（CCK-8）具有一定的抗炎作用，它可减轻LPS引起的大鼠心肌组织、肺脏、脾脏和肾脏白细胞浸润、毛细血管血液淤积等征象，抑制体内TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子的升高；体外实验证实，CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠PIMs的NF-κB活性和 WP=6 mCD14的表达，导致PIMs对LPS的敏感性降低，从而抑制炎症反应。以上研究结果显示了CCK-8抗炎作用的良好前景。 目前，有关CCK-8抗炎作用的受体及信号转导机制尚不清楚。CCK-8的抗炎作用是通过其受体介导的。既往发现使细胞内cAMP增加的物质可抑制NF-κB活性，减少巨噬细胞产生TNF-α，可见cAMP-PKA信号通路的活化可抑制炎症反应。在消化系统, CCK可激活cAMP-PKA通路和DAG-PKC通路，并且CCK可引起腹腔巨噬细胞cAMP含量增加而PKC活性降低，表明cAMP-PKA、DAG-PKC两条途径之间存在着互相抑制的cross-talk。在肺组织，有CCK-A和CCK-B两种受体亚型表达，但在PIMs，CCK受体的表达亚型是什么？其结合特性怎样？在信号传递过程中，CCK-8在NF-κB上游是通过哪条通路起作用的？目前未见相关报道。 本课题从CCK受体入手，研究CCK受体在PIMs上的表达亚型和结合特性，并探讨CCK受体-cAMP-PKA-NF-κB这条信号通路及其与DAG-PKC通路间的cross-talk，以期阐明CCK-8的抗炎作用机制。 1 大鼠PIMs CCK受体的表达亚型及结合特性 CCK具有一定的抗炎作用，其发挥生理功能是通过受体介导的。根据其对内源性CCK-8和胃泌素亲和力的不同，CCK受体主要分为CCK-A和CCK-B两种亚型，在体内分布十分广泛，但在大鼠PIMs，CCK受体的表达亚型和结合特性尚未见报道，本实验对此进行了探讨。SD大鼠10只，随机分为两组。实验组舌静脉注射5g·L-1的LPS 5 mg·kg-1，对照组注射等量生理盐水。用酶消化法结合肺泡耗竭灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化大鼠PIMs，超速离心法提取细胞膜，与3H标记的硫酸化CCK-8（3H-CCK-8S）进行放射配基结合实验，观察正常大鼠和LPS诱导48h后的大鼠PIMs膜与3H-CCK-8S的结合情况，观察孵育时间和温度对特异性结合的影响。并在最佳条件下制备膜受体与配基结合的饱和曲线，观察CCK受体的结合特性。用非标记的CCK-8S、CCK-A受体特异性拮抗剂CR-1409及CCK-B受体特异性拮抗剂CR-2945进行竞争抑制实验，观察CCK受体表达亚型。实验数据用均数±标准差( ±s)表示。3H-CCK-8S与膜结合的平衡解离常数（KD）和最大结合容量（Bmax）由Scatchard作图法经直线回归方程求得。CCK-8S和CR-1409及 CR-2945的IC50值由对数-几率单位法求得。结果显示：正常大鼠PIMs未能检出特异性结合， WP=7 静脉注射LPS 48h出现特异性结合，且对孵育时间和温度有依赖性，在37℃和21℃孵育条件下，3H-CCK-8S能够与膜迅速结合，30min可达平衡，但解离速度较快；而4℃孵育时，3H-CCK-8S与膜的特异性结合稳步升高，于3h达到平衡状态且不易解离，4℃孵育12h特异性结合仍然维持在平衡状态。经Scatchard分析，平衡解离常数KD值为：0.68±0.28nmol·L-1，最大结合容量Bmax值为32.50±2.70fmol·mg-1蛋白。在竞争抑制实验中，3H-CCK-8S与大鼠PIMs膜的结合可被CCK-8S、CR-1409和CR-2945所抑制，当拮抗剂浓度由10-12mol·L-1逐渐增加至10-6mol·L-1时，特异性结合进行性下降，呈剂量依赖关系。其IC50值分别为：2.30±0.80nmol·L-1、3.20±1.13nmol·L-1和0.19±0.06μmol·L-1。在所有的结合实验中，非特异性结合量占总结合量的
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R363

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本文编号：2790429