新型的以组蛋白H1～0为骨架的靶向于EGF受体的基因导入系统的构建

发布时间：2020-08-18 17:35

【摘要】： 本文构建了一种以组蛋白H10为骨架，靶向于表皮生长因子（EGF）受体的新型基因导入系统。其创新性在于，把基因导入系统中的各种功能成分组建成为融合基因，在大肠杆菌中表达，是化学合成基因导入系统的延续，属相关领域的首次尝试与报道。在以往的研究中，我们构建了多聚赖氨酸（polylysine）为骨架、靶向于EGF受体的基因导入系统。GE7-polylysine和HA20-polylysine是系统的两个组成成分。GE7是一种化学合成的16肽，靶向于EGF受体。HA20来源于流感病毒血凝素蛋白，是内吞小体释放寡肽。功能肽GE7、HA20分别通过化学交联与polylysine连接。在体内、体外导入实验中，这种polylysine为骨架的基因导入系统能够靶向性地将DNA导入EGF受体高表达的肿瘤细胞。但化学交联很难确定与polylysine连接的寡肽数目并且花费昂贵，限制了进一步的应用。基因工程方法能解决这些问题，但在大肠杆菌体内不可能表达polylysine，因此我们设计了组蛋白H10为骨架的基因导入系统。我们总共构建了九种融合蛋白，它们分别为GE7-histone-HA20, GE7-histone97-193-HA20, HA20-histone-GE7, Histone-GE7, Histone-HA20, Histone97-193-GE7, Histone97-193-HA20， Histone，Histone97-193。Histone和Histone97-193两种蛋白作为阴性对照。组蛋白H10和组蛋白H1097-193通过PCR从人胎盘cDNA文库中获得。与组蛋白H10或组蛋白H1097-193连接的GE7和HA20是从本人构建的表达序列GE7-protamine和HA20-protamine中PCR获得。通过一系列重叠的引物，数轮PCR"搭桥"反应最终获得九个融合蛋白的表达序列。所有的表达序列均克隆在pT7450原核表达载体中。 WP=5 融合蛋白的表达宿主菌是HMS174（DE3），表达产物通过SP Sepharose和Sephadex G-50纯化。所有的融合蛋白与质粒DNA混合后，都能阻滞DNA在1%琼脂糖凝胶中的迁移，电泳结果表明融合蛋白具有结合DNA的能力。DNA与蛋白结合的最佳质量比为1:3。我们采用了经免疫组化鉴定表达EGF受体的SKOV3裸鼠皮下移植瘤、BEL-7402细胞株、BEL-7402裸鼠皮下移植瘤作为靶细胞、组织以检测融合蛋白的生物学活性。U2OS细胞表面未检测出EGF受体的表达，作为导入实验的阴性对照。体外导入实验表明，只有2种蛋白组合（GE7-histone-HA20/Histone-GE7, Histone-GE7/Histone- HA20）能将(-gal基因导入表达EGF受体的细胞，其他组合或单独的蛋白均不能将DNA靶向性地导入EGF受体高表达的细胞。体内导入实验表明，未连接GE7或HA20的组蛋白不能将DNA靶向性地导入细胞，单独Histone-HA20也是同样的结果；单独的Histone-GE7，GE7-histone-HA20，HA20-histone-GE7组的肿瘤中仅检测出少量(-gal基因的表达；将Histone-GE7和Histone-HA20等量混合后，(-gal基因的表达有所增加；GE7-histone-HA20和Histone-GE7等量混合后，SKOV3和BEL-7402肿瘤中可检测到大量(-gal基因的表达。体外导入筛选实验表明，Histone97-193为骨架的基因导入系统活性不如Histone全长。GE7-histone-HA20/Histone-GE7蛋白组合是经体内外导入实验筛选获得的最佳基因导入系统。我们同时研究了GE7-histone-HA20/Histone-GE7蛋白组合介导的(-gal基因在肿瘤组织中的表达随时间推移的变化：在皮下瘤周注射后12小时，就有(-gal基因的表达，24小时表达达到高峰，48小时开始下降，96小时、7天、10天表达继续下降，2周后肿瘤组织内仍有少量(-gal基因表达。肿瘤组织中导入的(-gal基因的表达水平还随复合体剂量的增加而上升。含DNA 1(g的复合体是皮下瘤周注射的最佳剂量。这一设计思路将基因导入系统中各种功能成分连接后通过基因工程方法表达，属首次尝试与报道，因此仅仅是一个起点。由于给药后，复合体颗粒要历经细胞内外的重重障碍，才能到达靶细胞核，在整个过程中，有众多干扰因素阻碍着复合体的导入进程，增加复合体颗粒的稳定性，避免被降解是该研究今后的发展方向。通过聚乙二醇化可使DNA与融合蛋白形成的复合体稳定性增加。这是在颗粒进入靶细胞前，维持稳定不被降解的对策。通过对复合体颗粒的修饰，完善基因导入系统，以排除细胞内外的干扰，将为今后的临床基因治疗奠定基础。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

【参考文献】