小鼠NAFLD模型建立及Nrf2缺失对肝脏中CYP2A5表达的影响

发布时间：2020-08-28 19:41

　　随着人们生活方式和饮食结构的改变，脂肪和糖类的过多摄入，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率呈逐年增高趋势。NAFLD主要包括，单纯脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎和肝硬化。某些病例还与肝脏肿瘤有关。“二次打击”学说被认为是其主要发病机制，但仍不十分清楚，目前有效的治疗药物也较少。核因子相关因子-2(NF-E2-related Factor2,Nrf2)，几乎存在各种细胞中，其作用引起了国内外广泛的研究。许多文献表明其在肝脏的相关疾病中，起着重要的作用。Nrf2可以通过调控细胞内抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶来抵抗氧化应激、减轻肝脏炎症、对抗肝细胞凋亡等。作为生物体主要的Ⅰ相代谢酶，CYP2A5是肝微粒体混合功能氧化酶系中最重要的一种，不仅与药物的生物转化等代谢环节密切相关，也和某些疾病的发生发展有关。研究表明，直接或间接由各种毒性化学物质或疾病引起的肝损伤，在炎症或肝硬化区域相邻的肝细胞CYP2A5是呈现增量表达。镉诱导氧化应激中，野生型小鼠肝细胞CYP2A5表达升高，而Nrf2敲除小鼠肝细胞CYP2A5表达没有变化。本实验前期研究结果已经证明，非酒精性脂肪肝模型鼠肝脏CYP2A5的表达量显著升高。但研究其两者在非酒精性脂肪肝发病过程中的变化及其相互影响，鲜有报道。为了探索非酒精性脂肪肝诱导的CYP2A5增量表达与Nrf2的相关性，本试验以野生型和敲除Nrf2的ICR小鼠为实验动物，根据前期建立的非酒精性脂肪肝模型的方法，采用高脂饲料配方建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，采用免疫组化法研究非酒精性脂肪肝模型鼠肝细胞中Nrf2与CYP2A5的表达关系以及敲除Nrf2基因对非酒精性脂肪肝病条件下CYP2A5表达的调控作用。将实验动物随机分为野生型高脂组（WT-HFD）、野生型对照组（WT-ND）、Nrf2敲除高脂组（KO-HFD）和Nrf2敲除对照组（KO-ND），分别饲喂高脂饲料或普通标准饲料。分别在4、6、8周剖杀部分小鼠，根据小鼠的血清生化指标、肝指数、肝脏病理组织学变化等指标评价模型鼠随疾病进程的发展而发生的变化。比较KO-HFD小鼠与WT-HFD小鼠疾病进程，分析Nrf2对疾病的影响。采用免疫组化方法分析野生型小鼠和Nrf2基因敲除鼠肝脏中CYP2A5的表达量随疾病进程发展发生变化以及Nrf2对CYP2A5表达的影响。研究结果表明：（1）采用高脂饲料连续饲喂8周，小鼠血清生化指标和脂质发生明显的改变。其中血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷酰转肽酶（GGT）、总胆固醇(T-Chol)、低密度脂蛋白(LDL)和葡糖糖（GLU）均呈升高趋势；但甘油三酯(TG)为降低趋势。WT-HFD和KO-HFD小鼠血清中ALT、AST与T-Chol，与各自对照组相比，极显著升高。在4、6、8周时，KO-HFD小鼠的血清中ALT、AST、T-Chol及GLU含量要显著高于WT-HFD小鼠。可见Nrf2对NAFLD疾病发展有明显影响。KO-HFD小鼠ALT和T-Chol含量，8周显著高于4周，总体呈升高趋势。WT-HFD小鼠T-Chol含量，8周时显著高于4、6周。（2）病理组织学结果显示，4-8周时与各自对照组相比，KO-HFD小鼠和WT-HFD小鼠肝组织出现显著的脂肪变性，以中央静脉周围为主，多为大、小泡混合型脂肪变性，可见炎性细胞浸润。在6-8周时KO-HFD小鼠脂肪变性和炎症活动显著高于WT-HFD小鼠。8周时，相比WT-ND小鼠，KO-ND小鼠肝脏中有脂肪颗粒，但不显著。提示Nrf2与非酒精性脂肪肝的发病机制有关系，Nrf2可能保护肝脏降低NAFLD中脂肪变性程度；敲除Nrf2会影响小鼠脂质代谢。8周的WT-HFD小鼠肝脏脂肪变性程度极显著大于4、6周WT-HFD小鼠，而4与6周WT-HFD鼠的脂肪变性程度差异不显著；4-8周各组KO-HFD小鼠的肝脏脂肪变性程度差异极显著。4-8周时，WT-HFD各组肝脏炎症活动度差异显著；KO-HFD小鼠肝脏炎症活动度8周时显著高于6周，且8、6周极显著高于4周。（3）相比WT-ND小鼠，WT-HFD小鼠肝脏中Nrf2和CYP2A5表达量极显著升高。4-8周，WT-HFD各组小鼠肝脏中Nrf2表达量呈极显著的升高；4-8周，WT-HFD各组小鼠肝脏中CYP2A5表达呈显著上升，Nrf2与CYP2A5的表达呈正相关性。（4）4-8周时，KO-ND小鼠肝脏中CYP2A5的表达低于WT-ND小鼠，但差异不显著；4-8周时，KO-HFD小鼠肝脏中CYP2A5的表达量极显著低于WT-HFD小鼠。在Nrf2敲除小鼠中没有检测到Nrf2的阳性表达。提示抑制Nrf2表达，CYP2A5的表达量降低，Nrf2在非酒精性脂肪肝中调控CYP2A5的表达；相比于KO-ND，KO-HFD小鼠中CYP2A5表达量略有升高，但不显著，提示CYP2A5的调控还可能涉及除Nrf2以外的其他转录或调节因子。本试验在成功建立小鼠NAFLD模型的基础上，旨在检测各组小鼠肝脏组织中Nrf2和CYP2A5的表达情况，研究NAFLD模型小鼠肝脏组织的Nrf2和CYP2A5的相互关系，以及可能引起这些变化的因素，如脂肪酸蓄积、脂肪变性和炎症等，从而探讨Nrf2和CYP2A5在NAFLD发生发展中的相互作用机制。同时为NAFLD新药的研制和开发提供新的线索。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R575.5;R-332
【部分图文】：

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0246810WT-ND KO-ND WT-HFD KO-HFDLU（Gmol/L）m468AB BCB图 3-13 高脂饲料对小鼠血清中 GLU 的影响Fig3-13 Effect of High-fatty-diet on serum GLU in mice3.3 病理学观察3.3.1 高脂饲料对肝脏眼观的影响从肝脏外观来看，对照组小鼠肝脏大小颜色正常，肝脏边缘整齐，呈红褐色，有弹性；T-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝脏发生明显的变化，体积变大，有油腻感，颜色呈灰黄色，肿大碎。并且饲喂高脂后，胆囊变大，胆囊中有颗粒物。WT-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝脏外观差不明显。在部分 KO-HFD 小鼠肝脏有小出血点。结果见图 3-14 和图 3-15。

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图 3-15 高脂对小鼠肝脏外观的影响. KO-HFD，4 周；B. KO-HFD，6 周；C. KO-HFD，8 周；D. KO-ND，4 周；E. KO-ND，6 周；F. KO-ND，8 周Fig3-15 The appearance of liver in every grouup.. KO-HFD，4W；B. KO-HFD，6W；C. KO-HFD，8W；D. KO-ND，4W；E. KO-ND，6W；F. KO-ND，8W3.3.2 高脂对小鼠肝脏组织学变化的影响光镜下，WT-ND 小鼠肝脏细胞完整，肝索整齐，肝小叶正常。4 周时，KO-ND 小鼠肝胞完整；随着时间加长，8 周时 KO-ND 小鼠肝脏中出现少量的脂肪空泡，并且肝索间隙变，相比于 WT-ND 小鼠肝细胞排列紊乱。经饲喂高脂，WT-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝脏有明的脂肪变性、肝细胞膨胀变圆，脂肪变性主要位于中央静脉周围。4 周时，WT-HFD 和O-HFD 肝脏脂肪变性达到 1/3，已经达到轻度的脂肪变性。随着饲喂时间加长，WT-HFD KO-HFD 肝脏脂肪变性加重，KO-HFD 小鼠肝脏有炎性细胞浸润，并有气泡样变。结果见 3-16、图 3-17。油红染色后，相比于 WT-ND，KO-ND 小鼠肝脏有少量的脂肪滴红染；T-HFD 和 KO-HFD 小鼠肝脏有明显的红色脂肪滴。结果见图 3-18。

图 3-16 高脂对野生型小鼠肝脏病理学变化的影响A.WT-ND,4 周；B.WT-ND,6 周；C.WT-ND,8 周；D.WT-HFD,4 周；E.WT-HFD,6 周；F.WT-HFD,8 周Fig 3-16 Liver hematoxylin and eosin stain in every group.(HE,10×20)A.WT-ND，4W；B.WT-ND，6W；C.WT-ND，8W；D.WT-HFD，4W；E.WT-HFD，6W；F.WT-HFD，8W

【参考文献】