小鼠心肌干细胞的体外分离培养、分选与鉴定及他汀对心肌干细胞存活的研究

发布时间：2020-09-07 13:41

　　背景：研究表明心脏存在干细胞,具有自我更新和多向分化的能力。2011年及2012年国外已开展心肌干细胞用于急性心肌梗死及缺血性心肌病的临床试验,其中SCIPIO利用c-kit阳性心肌干细胞治疗心衰,EF显著提高；而CADUCEUS实验利用小球(cardiosphere)治疗急性心梗,局部心肌活力改善,但左室射血分数无显著性差异。最新的动物实验表明心肌干细胞用于治疗急性心肌梗死效果优于骨髓单个核细胞和骨髓间充质干细胞。然而,心肌干细胞的提取、分离、扩增过程周期长,较其他细胞更为复杂。建立成熟的细胞培养方法成为以后基础研究和临床试验的前提条件。同时,既往的研究表明,单纯输注干细胞治疗心梗后心衰效果有限,这是因为细胞驻留率不高及心肌梗死后恶劣的微环境所致。因此,提高干细胞本身的活力及改善移植后干细胞生长的微环境策略是近年研究的热点。目的： 1)建立从成年小鼠心脏组织中分离培养得到c-kit阳性心肌干细胞的有效方法； 2)探索阿托伐他汀对心肌干细胞在缺氧/无血清培养下的作用。方法: 1)心肌干细胞的分离培养和扩增：无菌条件下取2月龄成年C57BL/6小鼠心脏,PBS洗涤,剪碎,经胰蛋白酶和胶原酶IV消化后,置于Matrigel组织块培养基(complete explant medium, CEM)中培养。大约2周后,收集心肌组织旁爬出成纤维状细胞板层上的小、圆、亮的细胞,接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中,予以心球生长培养基(cardiosphere-growing medium, CGM)继续培养,传代扩增后再通过磁珠分选收集纯化的c-kit阳性心肌干细胞。分选前及分选后用流式细胞仪分析所得细胞其表面抗体c-kit和sca-1的表达。2)他汀对缺氧/无血清心肌干细胞的作用：分选后的心肌干细胞置于含不同浓度他汀(对照组,10-3μ mol/l,10-2μ mol/l,10-1μmol/l,1μ mol/l,10μ mol/l)的无血清心球生长培养基中,在缺氧12小时后观察细胞形态的变化,用流式细胞法分析细胞凋亡比例。绪慕: 1)心肌干细胞培养：消化后的心肌组织3天后可见成纤维样细胞从组织块儿周围爬出,1周后可见小、圆、亮的细胞出现在组织块周围爬出的成纤维细胞层上。传代培养后,倒置显微镜下观察细胞形态呈较均一的梭型,可见心肌干细胞形成的“太阳状”集落。磁珠分选可获得分选前大约1%的细胞。流式细胞分析磁珠分选后c-kit阳性率为18.59%,sca-1阳性率为56.7%;而分选前c-kit阳性率为3.44%,sca-1阳性率为53.46%。2)他汀对缺氧/无血清干细胞的作用：高浓度他汀(1μ mol/l,10μmol/l)组较对照组镜下观察细胞皱缩明显,流式细胞仪初步分析凋亡率较对照组高(对照组：20.5%,1μ mol/l:29.5%,10μ mol/l:28.2%, p0.05);低浓度他汀较对照组凋亡率(对照组：20.5%,10-3μ mol/l:19.2%,10-2μ mol/l:23.2%)不明显。结伦：联合利用酶消化和磁珠分选法可以成功从成年小鼠心脏组织中分离培养得到c-kit阳性干细胞。他汀对心肌干细胞的作用有待进一步实验探究。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2

【共引文献】