人源性抗角蛋白抗体的基因克

发布时间：2020-09-08 10:09

　　研究表明，人体内天然存在的抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody，AK auto Ab)是维持机体免疫状态平衡的重要成员。一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等)，AK auto Ab的存在有利于限制病情的进展，促进损伤的修复，对机体具有有益的保护作用。动物实验和体外研究都提示当机体内AK auto Ab水平低下时人为补充抗角蛋白抗体有可能成为该类疾病新的治疗措施。为此我们尝试采取基因工程的方法，利用噬菌体抗体库等技术制备具有高特异性和高亲和力的人源性抗角蛋白抗体。半合成噬菌体抗体库库容4.0×10~8，经扩增后滴度为1×10~(14)cfu／ml。以人表皮角蛋白为抗原对其进行4轮“亲和吸附—洗脱—扩增”筛选，挑取单集落培养表达噬菌体抗体并鉴定其与角蛋白结合的活性和特异性；初步获得的阳性克隆经可变区基因指纹分析确定其基因种类的异同，选择不同的克隆以内切酶去除载体上的基因Ⅲ，表达可溶性Fab段，进行进一步鉴定。亲和力成熟采用链替换技术，分离未经免疫的正常人淋巴细胞提取RNA，RT-PCR扩增K轻链基因和IgG／IgM重链Fd段基因分别构建轻链库和重链库。先以筛选所获克隆的重链与轻链库随机搭配进行轻链替换，对形成的换链库采用解离速率筛选法(off-rate selection)选取亲和力提高的克隆；然后再将获得的轻链基因与重链库基因重组进行重链替换，筛选亲和力进一步提高的克隆，并进行抗体抗原结合活性及特异性检测、亲和力测定和可变区基因序列比较分析。通过筛选获得了4个能与角蛋白特异结合的噬菌体抗体克
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2000
【中图分类】：R346
【部分图文】：

指纹图谱,可变区基因,指纹图谱,阳性克隆

18个特异阳性的克隆经PCR扩增，其中17个均扩增出K链和重链Fd段。扩增产物经CL一6B分子筛纯化后以Hinfl酶切得到4种不同的酶切图形，见图4。说明17个阳性菌落系来自4个不

阳性克隆,基因,质粒,条带

Fig4Hinff6ngerPrintingoftheVgenesofthePositvieelones将4种阳性克隆的质粒以N’heI酶切，电泳显示均有6obop士的基因m条带放出，见图5。酶切液连接后电转化.EocliXLI一Blue，挑取单集落培养提质粒用Smal+Sacl酶切证明基因m已被切除见图6(带有基因m者放出约.27kb和2.Ikb条带，无基因m者放出约2.7kb和1.4kb条带，酶切位点见图1)。各克隆菌液用PITG诱导表达可溶性Fba段，EUSA检测显示4种克隆均表达出了人Fba。以不同浓度人gIG的EuSA读数绘制标准曲线，计算各克隆表达Fba段的相对含量大约在100n创ml~1000n留ml左右，见表5;再以ELISA检测Fba的抗原结合活性，发现仅克隆1表达出了能与角蛋白抗原特异性结合的Fba抗体

可溶性,表达载体,酶切鉴定,基因

的基因m条带放出，见图5。酶切液连接后电转化.EocliXLI一Blue，挑取单集落培养提质粒用Smal+Sacl酶切证明基因m已被切除见图6(带有基因m者放出约.27kb和2.Ikb条带，无基因m者放出约2.7kb和1.4kb条带，酶切位点见图1)。各克隆菌液用PITG诱导表达可溶性Fba段，EUSA检测显示4种克隆均表达出了人Fba。以不同浓度人gIG的EuSA读数绘制标准曲线，计算各克隆表达Fba段的相对含量大约在100n创ml~1000n留ml左右，见表5;再以ELISA检测Fba的抗原结合活性，发现仅克隆1表达出了能与角蛋白抗原特异性结合的Fba抗体，另3个克隆所表达的Fab不能与角蛋白抗原结合见表6。表中的阳性对照为从人外周血提取的多克隆抗角蛋白抗体(gIG一AKuatoAb)

【参考文献】