弓形虫GRA6和SAG1基因克隆及其表达产物的应用研究

发布时间：2020-09-08 11:03

　　 目的：从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中克隆GRA6基因片段， 构建重组质粒pGEX-GRA6，与本实验室已构建好的重组质粒 pGEX-SAG1分别导入大肠杆菌中表达，且对表达产物进行纯化，以 纯化的该两种重组蛋白作为诊断抗原，构建新型弓形虫基因工程诊断 试剂盒，用于检测弓形虫感染及鉴别急、慢性期弓形虫病。 方法：1．用CF-11纤维素柱快速提纯弓形虫速殖子，抽提弓形虫总 DNA；根据基因库已报告的基因序列，设计并合成扩增GRA6基因 的一对引物，采用聚合酶链反应(PCR)从昆山分离株和RH株总 DNA中分别扩增编码GRA6的基因片段，导入质粒pBluescriptIIS(-)， 经DNA测序分析后，从构建好的重组质粒pSK-GRA6中以BamHI 和EcoRI双酶切出GRA6基因片段，以相同的酶切位点导入表达质 粒pGEX-5X-3，构建重组质粒pGEX-GRA6。将重组质粒pGEX-GRA6 转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株中，在IPTG诱导下表 达，超声破壁后，SDS-PAGE分析表达产物的表达形式，对上清液中 表达产物经硫酸铵沉淀、Sephadex G50脱盐和GST亲和层析柱进行 目的蛋白的纯化。通过Western blotting检测其纯化重组抗原的免疫 反应性。用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建立间 接法ELISA检测弓形虫感染者血清特异性GRA6-IgM和GRA6-IgG 的诊断方法；用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建 立胶体金斑点渗滤法(DIGFA)检测弓形虫感染者血清特异性IgM 弓形虫GRA6和SAG!幕l州克降表达及其产物的应用 中文摘要 和工gG的方法。2.将重组质粒pGEX一SAGI转化大肠杆菌BL21一Codon Plus(DE3)一RP菌株中，在IPTG诱导下表达;超声破壁后，sDs一队GE 分析表达产物的表达形式。通过改变培养温度和LB培养液pH，诱 导重组蛋白在上清液中表达，并对上清液中表达产物经硫酸按沉淀、 SephadexG一50脱盐、GST亲和层析柱和sephadexG一1 50凝胶过滤柱 进行目的蛋白纯化。通过Westem blotting检测其纯化重组蛋白的免 疫反应性。用获得的纯化GST一SAGI重组蛋白作为包被抗原，建立 间接ELIsA法检测人血清中弓形虫特异性IgM和IgG抗体的诊断方 法。 结果1.在我们所比较GRA6 336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH 株之间碱基基本一致;得到一分子量为49kDa的重组蛋白，通过 westem blotting证实该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM 和IgG所识别。GRA6以融合蛋白(GST一GRA6)的形式在大肠杆菌中 得到了高效表达。对表达产物亩溶性分析表明，表达蛋白在上清液中 和包涵体中均有表达。在上清中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度 可达90%以上。用纯化的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒 和DIGFA诊断试剂盒对弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。 2.在常温条件下(37‘C)，SAGI以融合蛋白(GST一SAGI)的形式在大 肠杆菌中得到了高效表达，对表达产物可溶性分析表明，表达蛋白以 包涵体形式存在。在低温和升高LB培养液pH条件下，在上清液中 得到了可溶性重组蛋白，经纯化后蛋白纯度可达90%以上。Westem 弓形虫川之八6和S八(月呆}川克降表达及比产物的应用甲丈、芍吐 b!otting分析表明一该纯化蛋白能被弓形虫感染者一血一清所识别。川纯化 的SAG!重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒对弓形虫感染者血一清进 行sAGI一lgM一ELISA检测，结果显示:该诊断试剂盒只对部分弓形 虫多克隆IgM抗体血清呈阳性结果，选用其中一份阳性和一份阴性 血清进行免疫印迹试验，其结果与我们用SAGI一IgM一ELISA检测结 果相同，表明我们研制的检测SAGI一工gM一ELISA诊断试剂盒司一用于 急、慢性期弓形虫感染的鉴别。 结论1.①弓形虫昆!_助分离株和RH株GRA6基因片段少匕乎完全一 致;②在大肠杆菌中得到了高效表达的可溶性重组蛋白GST一GRA6; ③该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM和工gG所识别，可 用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫感染检测试剂盒。用纯化 的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒和DIGFA诊断试剂盒对 弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。 2.①在大肠杆菌中表达了GST一SAGI重组蛋白;②通过改变培养温度 和LB培养液pH，首次成功地在上清液中得到了可溶性SAGI重组 蛋白;③该可溶性重组蛋白能被急性期弓形虫感染者血清IgM所识别， 可用于构建弓形虫检测试剂盒，鉴别急、慢性期弓形虫感染。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【部分图文】：

400p1buffe:A(1SOmMNaCI25mMDs和蛋白酶K(proteinaseK)，处理Zhr，冷却至室温后加等体积水乙醇和0.3倍体积的3M乙酸，以12，000r/min离心3Omin，去上in，后12，000r/minIOmin，去上清，存放一70℃冰箱。结果提纯弓形虫结果:虫体回收率为25胞清除率<10%;收集液离心镜检

A的1%琼脂糖电泳结果，昆山株geleleetroPhorsisforidentifinedwithE.BLane2.kunshanstrain讨论法较多，各有优缺点[35]。释放，提高虫体回收率，原。但所需时间长，工作力有较大差别，处理时间，，

1.GRA6基因的PCR扩增和重组质粒的构建用我们设计的引物分别从弓形虫昆山分离株与R士1株总DNA上扩增GRA6基因片段，均得到一长度为336bP的基因片段(图1)。

【引证文献】

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1 王妍;弓形虫GRA3基因的原核表达及单克隆抗体的制备与初步应用研究[D];延边大学;2012年

本文编号：2814101