抗基孔肯亚病毒单克隆抗体人源化及真核细胞高效表达研究

发布时间：2020-09-10 21:15

　　 本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞中表达具有中和 活性的抗基孔肯亚(chikungunya，Chik)病毒的嵌合抗体，以图为Chik病的治疗提供被动 免疫制剂。 为表达嵌合抗体，首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源单克隆抗体 (monoclonal antibody，McAb)VL和VH基因及人工gG1亚类的CH和CK基因，通过融合PCR 构建了抗Chik病毒的完整人-鼠嵌合抗体基因。将人-鼠嵌合抗体基因克隆到表达载体 的多克隆位点(mutiple cloning site，MCS)，构建了恒定区(constant region，C区) 为cDNA序列的表达质粒。 将构建的嵌合抗体表达质粒转染CHO／dhfr-细胞，经氨甲喋呤(methotrexate，MTX) 加压筛选，获得最高表达量为2μg／ml的细胞株。对此细胞株扩大培养并纯化抗Chik病 毒的嵌合抗体。纯化的嵌合抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD的带，在还 原SDS-PAGE中表现为一条约50kD和一条约25kD的带；Western印迹结果显示，全分子 蛋白和重链(heavy chain，H链)分子均可与羊抗人IgG Fc发生特异性免疫反应；全分 子蛋白和轻链(light chain，L链)分子均可与羊抗人Kappa发生特异性免疫反应。用 间接免疫荧光实验(indirect immunofloresence assay，IFA)检测显示，纯化的嵌合 抗体与Chik病毒抗原发生强反应，说明表达的嵌合抗体保留了亲本鼠源McAb的抗原结 合活性。用不同浓度的纯化嵌合抗体和鼠源McAb进行微量细胞中和实验，结果25μg／ml 的嵌合抗体和15μg／ml的鼠源McAb可以保护细胞不出现病变，说明嵌合抗体具有与鼠 源McAb相同的生物学活性。 为了提高嵌合抗体的表达量，我们尝试用Flp-InTM系统表达嵌合抗体，获得表达量为 1μg／ml的稳定表达细胞株。遗憾的是此系统不能进行基因扩增，基于此，我们构建了在 染色体的转录活性位点整合了FRT序列的CHO／dhfr-细胞株，命名为CHO／dhfr-FRT+。在 此细胞株中，表达了抗chik病毒的嵌合抗体，通过MTX加压筛选，获得表达量为5μg／ml 的稳定表达细胞株，是Flp-InTM表达系统的5倍，是CHO／dhfr-表达系统的2． 5倍。 有报道称，Ck基因组序列能改善抗体在CHO细胞中的表达。但未见CH基因组序列是 否较cDNA序列表达量高的报道。因此克隆人抗体分子IgG1亚类CH区基因组序列并构建 了C区为基因组序列的双基因表达质粒，用F1p-InTM系统研究了C区为cDNA序列和基 因组序列对抗体表达量的差异，结果显示CH区使用cDNA序列是基因组序列抗体表达量的 3倍。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

一IVL.和V

通过融合PCR方法扩增嵌合抗体L、H链基因(见图1一4)，并将扩增产物克隆到pMD一T载体上(见图1一5)进行DNA序列测定，结果见图1一6。工gGI是由L链和H链组成的异源二聚体分子，含有4对链间二硫键和犯对链内二硫键，见图1一7。我们得到的完整嵌合抗体L、H链基因氨基酸序列分别含有5个和n个半肤氨酸，与预期结果完全一致。12312丛二_2000—匕00250—100bP15000100007500500025001000250图1一4嵌合抗体L?

humanlgG:4:MouseMeAbagainstChikVlrLIS图3一4纯化的嵌合抗体的Western印迹分析Fig3一4W七sternblotanalysisofthePurifiedehimerieantibody1and4:MouseMeAb;2ands:StandardhumanIgG:3and6:Purifiedehimerieantibody:4:Proteinm毗e:(人斤xlo3)2.5纯化的嵌合抗体的SDS一以GE和Western印迹取2陀纯化的嵌合抗体进行SDS一PAGE和Western印迹检测，结果见图3一3和图3一4。在非还原SDS一PAGE电泳中，显示一条约150kD的蛋白条带(未显示图片);在还原SDS一PAGE电泳中，显示2条带，经过TOTALLAB软件分析相对分子质量分别为52kD和24kD，分别与H链和L链的预期大小一致，见图3一5。用H即标记的羊抗人工gGF。进行Western印迹实验，结果显示与全分子抗体和H链均可发生反应

【共引文献】

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8 马s

本文编号：2816342