肝再生过程中的LncRNAs调控肝细胞增殖的机制研究

发布时间：2020-09-28 21:30

　　肝脏是人体各种物质代谢、能量转换的枢纽消化器官，是机体内多种重要信息调控分子的重要场所。肝脏具有很强大的再生能力，物理性及化学性创伤和各种肝脏病后，残存的肝脏组织很快会进入复杂的肝再生过程。肝再生过程基本可分为三个阶段：早期阶段（启动期），中期阶段（增殖期）和晚期阶段（终止期）。肝再生一直是肝脏研究中的一个重要焦点，原发性肝癌、肝内胆结石等肝脏病进行肝部分切除术后常因肝功能储备不足，术后并发肝功能衰竭而死亡率较高。因此研究肝再生分子机理对于解释肝脏病人肝叶切除术后残余肝脏的再生机制，实施有效的促肝细胞增殖能力的手段，减轻肝叶切除术后的肝损害及评估预后具有重要的临床意义。因为影响肝细胞再生的机制的因素非常复杂，对肝脏再生的启动和增殖信号（包括激素、生长因子和细胞因子等）的分子机制认识有了初步了解。主要研究发现有细胞因子(IL-6、TNF-a)和转录因子(c-jun、STAT3)等组成启动肝再生的信号转导通路，进而提高促有丝分裂因子对肝细胞的增殖能力的影响从而完成肝再生启动。在多种促有丝分裂因子如肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF-a）等，以及辅有丝分裂因子去甲肾上腺素和胰岛素等的共同作用下促使肝细胞进入增殖阶段，进行细胞DNA合成和细胞有丝分裂。相关基因如c-myc、β-Catenin等，一些microRNA如miR-378、miR-221、miR-21等参与了这个复杂过程，但是对肝再生的分子作用机理，特别是肝再生不同再生阶段的机制仍不清楚。全面阐释肝再生过程中的调控机制，揭示肝再生过程中调控的关键分子，是研究肝细胞再生机制的关键科学问题。随着短链非编码RNA（如microRNA）研究的深入，和一些新的克隆、测序和芯片（tiling array）技术的应用，大量长片段的非编码RNA被发现，他们在生命活动中的重要意义逐渐被揭示。目前，将这一类转录本长度超过200nt的ncRNA称为长链非编码RNA（Long noncoding RNA, LncRNA），哺乳动物基因组序列中4%-9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%）。已有的研究显示，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰及核内运输等多种重要的调控过程，在生理及病理过程中发挥着重要作用。如lincRNA-p21可被p53转录活化，并且可影响众多p53靶基因的表达，在p53信号通路中起着重要的作用。Zhu等鉴定的膀胱癌中的一个长链非编码RNA-ncRAN在膀胱癌中高表达，并且和膀胱癌的侵袭、分期相关。在前期研究中本课题组利用肝癌与癌旁组织lncRNA芯片，鉴定出lncRNA-HEIH在肝癌组织中高表达，并且和病人预后成负相关，过表达lncRNA-HEIH可促进肝癌的生长。但哪些lncRNA参与了肝再生过程还未见报道。第一部分H19通过形成myc相关的自反馈环路促进肝细胞增殖上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得转移和侵袭能力的重要生物学过程，也是参与肝脏损伤修复的重要环节，肝再生过程中内皮细胞分泌的肝生长因子HGF可以诱导肝细胞发生上皮-间质转化（EMT），新近的研究发现肝再生过程中存在上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）的平衡，某些特定类型的上皮细胞发生上皮间质转化从而能够获得间质表型，其中一些间质细胞能够产生大量的细胞外基质最终导致肝的纤维化；但是另一些间质细胞能够经过其反过程间质上皮转化，这些间质细胞重新转变成上皮细胞，最终形成正常的肝细胞，使得损伤肝脏的修复正常，因此研究肝再生过程中调控肝细胞上皮-间质转化的新分子及其作用机制，对理解肝再生损伤修复的过程的分子机制有理论意义。但目前哪些lncRNA通过调控上皮-间质转化而参与了肝再生过程还未见报道。 H19是一个已知的长2.3kb的非编码RNA分子，其母系等位基因表达，父系印迹，在哺乳动物中呈现进化上的保守性，是最早被鉴定的印迹基因之一。近年发现H19可以通过调控上皮-间质转化在胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作用，但目前H19调控肝再生的机制还尚不明确。因此本课题建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，发现了在肝再生过程中发挥重要作用的已知长链非编码RNA H19。揭示了H19在肝再生过程中的调控机制：H19的5’端可与hnRNP U蛋白相互作用，并且增强了下游c-myc mRNA的稳定性使之上调表达，从而促进了肝细胞的增殖能力。同时，c-myc可以与H19的启动子区结合从而促进了H19的上调表达，形成H19的自反馈环路。H19/hnRNP U/c-myc调控网络通过调控EMT过程增强了H19在肝再生过程中促进肝细胞增殖能力的作用。第二部分lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进肝细胞增殖 Wnt/β-Catenin信号通路在众多组织中是调控细胞增殖、分化和迁移的重要通路，在许多组织的损伤修复中都发现存在Wnt/β-Catenin信号通路的活化，并且这种活化与组织损伤修复能力和成瘤倾向有关。在肝脏中，越来越多的证据表明Wnt/β-Catenin信号通路在肝脏的各种生物学功能中发挥着重要作用。近年来的研究表明，Wnt/β-Catenin信号通路对于肝切除术后的肝脏再生至关重要。但是哪些lncRNAs通过调控Wnt/β-Catenin信号通路促进了肝细胞的增殖及肝脏的再生依然尚未明确。因此本课题建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，通过lncRNA芯片筛选得到在肝再生过程中发挥重要作用的lncRNA-LALR1。揭示了lncRNA-LALR1在肝再生过程中的调控机制：在肝再生过程中，肝生长因子HGF上调，增加了lncRNA-LALR1表达。lncRNA-LALR1通过招募转录因子CTCF到AXIN1的启动子区抑制了Axin1的表达，激活了Wnt/β-Catenin信号通路，上调了cyclin D1的表达，加速了肝细胞G1期进程，缩短了细胞周期，促进了肝细胞增殖和肝脏再生。并在肝脏移植、各种肝病及肝肿瘤病人的组织中检测lncRNA-LALR1表达量，期望lncRNA-LALR1可能成为各种肝病及肝肿瘤肝叶切除术预后评估的检测指标。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

调节因子,肝再生,机制研究

肝再生过程中的 LncRNAs 调控肝细胞增殖的机制研究- 21 -图1-1. LncRNA-H19是参与肝脏再生和发育的共同调节因子Fig. 1-1. LncRNA-H19 is a more pivotal mediator involved in liver regeneration anddevelopment.The levels of lncRNA-H19 and lncRNA-hcn expressions were increased after PHx inmice. The top change of H19 RNA (A) was higher than that of hcn RNA (B). (C) Anextremely high expression of H19 presented in mouse fetal liver tissues and then the H19expression was down-regulated sharply after birth in mice. (D) Hcn expression exibited amild upregulation in mouse fetal liver tissues compared to in mouse adult liver tissues.The changes of H19 expressions in liver tissues from mouse models treated with ethanol(E), CCl4(F) and DEN (G) reagents. (H) The pathological changes in the livers fromliver toxic reagent-treated mice. Data are mean ± SD (n=3). *P ≤0.05; **P ≤0.001.

病理改变,酒精,化学,小鼠

第二军医大学博士学位论文- 22 -图1-2. lncRNA-H19和lncRNA-MALAT1在人胚胎肝细胞中的表达以及化学及酒精处理的小鼠肝脏病理改变Fig. 1-2. The expressions of lncRNA-H19 and lncRNA-MALAT1 in human primaryfetal hepatocytes.(A) Extremely high expression of H19 RNA in human primary fetal hepatocytescompared to in human immortal liver cells, LO2 cells. (B) Moderate increase ofMALAT1 in human primary fetal hepatocytes compared with in human immortal livercells, LO2 cells. (C-E). The pathological changes in the livers from liver toxicreagent-treated mice.（二）H19可以促进小鼠原代培养肝细胞及小鼠胎肝细胞增殖能力小鼠大部分切除术后，肝细胞分泌大量的各种肝生长因子从而激活了静止的肝细胞使之进入后续的细胞增殖阶段重新恢复肝脏大小及功能，肝细胞增殖是肝

- 24 -图1-3.H19促进小鼠原代培养肝细胞及小鼠肝细胞系的增殖能力Fig. 1-3. H19 promotes hepatocyte proliferation and viability in primary mousehepatocytes and mouse liver cell lines.(A) The H19 expression was up-regulated in the primary mouse hepatocytes transfectedwith pcDNA-H19 compared to with empty pcDNA3.1 plasmids. (B) Ectopic expressionof H19 enhanced the cell proliferation rate of primary mouse hepatocytes. (C) BNL CL.2cells and Hepa1-6 cells exhibited significantly high expression of H19 in comparisionwith CCL-9.1 cells. (D) The expression of H19 was up-regulated in the BNL CL.2 cellstransfected with pcDNA-H19 plasmids compared to empty plasmids. Ectopic expression

【共引文献】