腺病毒载体介导肝细胞生长因子对脊髓损伤的基因治疗及相关机理探讨

发布时间：2020-09-28 22:12

　　 目的 脊髓损伤是一类严重威胁人类健康的创伤，目前尚无有效的治疗方法。 已知脊髓损伤修复过程中神经再生、再次髓鞘形成和死亡神经元的替代都需要面 对胶质瘢痕及复杂的不利于神经再生的内环境，现已证实胶质瘢痕能抑制轴索生 长和髓鞘形成。胶质瘢痕最主要成分是星形胶质细胞，因此某些实验策略为通过 抑制胶质细胞增殖而促进神经再生。肝细胞生长因子(HGF)具有抑制瘢痕的作 用。本研究将腺病毒介导的肝细胞生长因子转染体外培养的星形胶质细胞，并对 该细胞进行划伤以模拟体内损伤，观察HGF对星形胶质细胞增殖的影响。 方法和结果(1) 在转染有绿色荧光蛋白基因的新生大鼠脊髓原代培养星形胶 质细胞中，观察到腺病毒对胶质细胞的转染率较高。以相应的Ad-HGF转染该细 胞后在培养液上清中有HGF表达。用间隔3mm的纵横平行线为模板对用6孔板 培养的该细胞进行划伤，制备体外损伤模型。通过检测星形胶质细胞特征性蛋白 胶质纤维酸性蛋白含量和细胞周期中S期比例，观察转染Ad-HGF的细胞在划伤 后不同时间点细胞增殖情况。结果发现Ad-HGF在细胞划伤后第一天对增殖有明 显抑制作用：(2) 3H掺入法观察HGF蛋白对正常培养的星形胶质细胞的作用，发现 HGF对正常培养的胶质细胞无明显作用；(3) 细胞划伤后用HGF蛋白作用30min， 通过检测促分裂原活化蛋白激酶(P42／414 MAPK)中表达和-磷酸鞘氨醇(SPP)，途径中 关键酶SPK水平，观察这两条对细胞增殖相关的信号途径，发现P42／44 MAPK这 条途径在胶质细胞中活性很高，显示可能对其生理功能有重要作用，但并没有因 HGF蛋白作用而增强。而SPK却在HGF蛋白低剂量作用下高表达，高剂量时表 达下降，说明HGF对其可能有双重作用：(4) 通过不同剂量HGF蛋白对星形胶质 细胞损伤后的影响，进一步阐明HGF对损伤后星形胶质细胞增殖的作用。 结论 肝细胞生长因子对正常生长的星形胶质细胞无作用，而对划伤的星形 胶质细胞的增殖具有双重作用，在低剂量是促进、高剂量时抑制增殖，SPP信号途 博士论文----一中文摘要 径在其中发挥作用。 第二部分肝细胞生长因子对脊髓神经再生的实验研究 目的治疗脊髓损伤的关键是促进神经再生，尽管目前还未彻底了解神经轴 索的再生机制，但研究表明，合适的微环境可以促进中枢神经再生。基因治疗脊 髓损伤的策略就是通过转基因技术提供一种合适的微环境，而目前主要是向局部 提供神经营养因子。神经系统中HGF广泛存在，且在大鼠发育的不同阶段，在大 脑不同部位HGF及受体表达量均有差异，提示其对大脑皮层神经元的分化、运动、 存活和神经发生上起作用。此外还观察到它对体外培养的皮层神经细胞有营养和 保护作用。迄今没有HGF对中枢神经再生作用的报道，本研究通过观察HGF蛋 白对体外培养脊髓神经组织离断突起的作用，证实HGF能促进神经再生，并在体 内通过Ad一HGF转染进一步证实其能促进皮质脊髓束的再生，为其在脊髓损伤中 的应用，奠定一定的理论基础。 方法和结果(l)建立一种体外观察神经再生的方法:首先铺鼠尾胶原，然后 接种胚鼠脊髓组织块，待5天后在发出突起部位约100一150um处将长出的突起离 断，于离断远端去除一块鼠尾胶原并重新铺胶，待胶固化后添加培养基，在原位 观察神经再生;(2)用建立的组织快模型观察HGF蛋白对神经再生的作用。重新铺 胶后换成N:条件培养基，24h:后通过观察再生突起的长度判断再生情况。结果证 实HGF对神经再生有促进作用;(3)体内进行Ad一GFP转染。通过冰冻切片观察转 染效果，发现在转染后1一2周时绿色荧光表达最强，直到第8周仍有表达;(4)脊髓 内转染Ad一HGF，并于转染同时进行脊髓左侧部分，背测2/3部分离断，2个月后 通过生物胞素顺行示踪观察皮质脊髓束再生状况，进一步证实HGF对神经再生有 促进作用。 结论建立了一种原位观察神经突起再生的方法，在此基础上证实肝细胞生 长因子体外能促进脊髓组织神经突起再生，体内能促进皮质脊髓束再生。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

图1.2星型胶质细胞(Ast)X200倍图1.3AST免疫组化x100倍图1.4AST免疫荧光X100倍图1.5AST转染Ad~GFP，MOI100，X200倍图1.6AST划伤模板图

图1.2星型胶质细胞(Ast)X200倍图1.3AST免疫组化x100倍图1.4AST免疫荧光X100倍图1.5AST转染Ad~GFP，MOI100，X200倍图1.6AST划伤模板图

AST免疫荧光X100倍

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘永良;孙培;李泽福;隋德华;刘鹏飞;邵伟;;Wistar大鼠骨髓源性神经干细胞分离与培养及其鉴定[J];滨州医学院学报;2010年06期

2 陈红江;骆文龙;;周围神经损伤再生的分子机制[J];重庆医学;2007年07期

3 詹瑞森;王卫国;隆海滨;;神经营养素-3对大鼠脊髓损伤后神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白表达的影响及意义[J];中国医师杂志;2006年12期

4 赵雯,史景泉,卞修武,万瑛,卢佳友;反义GFAP对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5增殖及分化的影响[J];第三军医大学学报;2004年18期

5 许红霞,糜漫天,朱俊东,周永,郎海滨,徐朝霞,陈卡;谷氨酸兴奋毒性及牛磺酸干预对大鼠视网膜GFAP表达的影响[J];第三军医大学学报;2005年11期

6 郑春霞,金卫林,鞠躬;氧化应激后大鼠神经元内Nogo-A的表达变化[J];第四军医大学学报;2004年19期

7 李烨;张家骅;吴建云;;大脑皮质星形胶质细胞的培养和鉴定[J];动物医学进展;2010年04期

8 阮林,刘仁刚,周洁萍;IL-1β对星形胶质细胞的激活作用[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2005年04期

9 刘铖,吴祖泽;胶质瘢痕与脊髓损伤修复[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2004年04期

10 郭亮;张建军;;新型番荔枝酰胺衍生物FLZ对去血清培养损伤星形胶质细胞的保护作用[J];国际药学研究杂志;2011年03期

相关博士学位论文 前10条

1 刘燕;周围神经不等径小间隙动脉套接吻合后再生机制的研究[D];吉林大学;2011年

2 魏岳腾;透明质酸基框架材料用于脊髓和面神经损伤修复的研究[D];清华大学;2010年

3 杨志军;大鼠脑内星形胶质细胞对渗透压改变的反应及其和神经元相互关系的形态学研究[D];第四军医大学;2002年

4 田纪伟;大鼠脊髓半横切伤损伤机制及恢复机理研究[D];第二军医大学;2003年

5 许红霞;牛磺酸对大鼠视网膜神经节细胞谷氨酸兴奋毒性的防护及机制研究[D];第三军医大学;2004年

6 杨建东;预防使用大剂量甲基强的松龙对大鼠急性脊髓损伤神经保护作用的实验研究[D];第二军医大学;2004年

7 刘百峰;载体介导RNA干扰沉默大鼠NgR基因对脊髓损伤的修复作用[D];第二军医大学;2006年

8 周建军;实验性脊髓损伤后胶质瘢痕形成病理学规律与影像学特征[D];第三军医大学;2005年

9 李振鹏;微电流刺激治疗大鼠横断性脊髓损伤的机理研究[D];汕头大学;2006年

10 施昱丞;针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的实验研究[D];北京中医药大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 石进峰;麝香提取物对大鼠皮层神经细胞炎性损伤的保护作用[D];郑州大学;2010年

2 李瑞梅;高血脂对脑缺血再灌注后大鼠海马GFAP与bFGF表达的影响[D];山西医科大学;2011年

3 贺永胜;BMSC与OEC联合移植对SCT大鼠神经元存活、胶质瘢痕以及神经再生的影响[D];昆明医学院;2011年

4 卢艺;OGD致星形胶质细胞胀亡钠钾ATP酶活性变化及药物干预[D];暨南大学;2011年

5 黄金城;骨髓间充质干细胞对脊髓损伤后胶质瘢痕影响的实验研究[D];福建医科大学;2011年

6 唐聪;急性脊髓损伤后pERK、PCNA、GFAP的表达和意义以及U0126对其表达的影响[D];福建医科大学;2011年

7 朱慧;转录因子Pax3对胶质纤维酸性蛋白基因的负性转录调控研究[D];南通大学;2010年

8 郭亮;新型番荔枝酰胺衍生物FLZ对去血清培养损伤星形胶质细胞的保护作用[D];北京协和医学院;2011年

9 叶维霞;超声微泡造影剂联合脂质体介导pNogo-R shRNA转染神经干细胞的体外实验研究[D];重庆医科大学;2011年

10 谢中;促红细胞生成素联合骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的实验研究[D];中南大学;2011年

本文编号：2829343