组织型纤溶酶原激活物DNA改组的探索研究

发布时间：2020-09-30 01:15

　　 tPA(tissue-type plasminogen activator)是活性和特异性最强的一种溶栓药物,但在体内短暂的半衰期很大程度上阻碍着该药发挥应有的作用。我们设想更高活性的tPA能在一定程度上缓解这一矛盾。 DNA改组(DNA shuffling)技术的问世为人们获得更高活性的基因表达产物提供了一个全新的技术平台。然而,迄今为止DNA改组仍只限于对原核表达产物有活性的一组基因的改组,对那些只有真核表达才有活性的基因的改组,由于筛选中存在的一系列困难而受阻。所以真核表达改组是人们努力的一个方向。本研究对这一技术在tPA分子定向进化中应用的可能性进行了探讨,期望这一探索性结果能够为后续几轮的tPA DNA改组探明道路,为最终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础,也为其它需要以真核表达为基础的DNA改组提供可借鉴的经验。首先我们采用RT-PCR方法获得一组哺乳类动物tPA的cDNA基因,包括大白鼠、恒河猴、人的tPA cDNA。将这些基因分别进行克隆、测序、原核与真核表达。测序结果表明恒河猴tPA cDNA编码区(含信号肽)与发表的人tPA cDNA编码区的核苷酸序列同源性为96%,由此所推导的氨基酸序列的同源性为97.5%。大白鼠tPA cDNA编码区(含信号肽)与文献发表的大白鼠tPA cDNA编码区的核苷酸序列,除2个碱基不同外,其余完全相同,与发表的人tPA cDNA编码区的核苷酸序列同源性约为80%(不含信号肽),由此所推导的氨基酸序列的同源性为83%。本实验所用的人tPA cDNA由本室提供,是经基因突变改造过的第二代人tPA基因。将恒河猴、大白鼠、人tPA cDNA克隆于真核表达载体,转染CHO细胞后表达出了有活性的tPA。培养上清检测结果显示人tPA在CHO细胞中表达产物的活性最高,恒河猴和大白鼠tPA的活性明显低于人tPA的活性。将这三种tPA基因分别克隆于原核表达载体,结果表明原核表达产物几乎没有活性。一个合适的表达筛选系统是DNA改组成功的关键。由于tPA只能在真核细胞中表达才有活性,所以DNA改组后的筛选只能建立在真核表达的基础上,这就意味着需要完成大量的探索性工作。本研究探索了DNA改组后的筛选途径,建立了大规模tPA活性筛选检测的方法。1.筛选途径:就是建立在真核表达系统的基础上,通过对单个细胞的克隆分离,实现筛选的第一步。真核表达中单个细胞克隆的获得比原核表达中单菌落的获得其难度和工作量要大得多。我们采用了稀释细胞,96孔板克隆的方法,从中摸索出了一些可行的经验和方法。2.筛选检测方法:大规模筛选的检测方法也是DNA改组的关键。DNA改组后的筛选检测方法不同于其他一些表达产物的检测可用简便的免疫学检测方法,改组后的筛选必须要检测表达产物的生物学活性,而且是大规模的检测。传统的tPA活性检测方法是琼脂平板法。该方法一次只能做几份至几十份的样品,无法适用于改组后一次完成几千至几万份样品的检测。我们将此方法进行了改良,建立了适用于tPA DNA改组后大样品量检测的筛选方法。在上述的基础工作准备完成后,我们以人tPA cDNA、恒河猴及大白鼠tPA
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R346
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分大白鼠、恒河猴、人tPA基因的克隆、测序与表达
第二部分以三种tPA cDNA为基础的DNA改组与筛选
第三部分人tPA的其它分子生物学改构
小结
参考文献
综述
致谢

【参考文献】