人免疫缺陷病毒Ⅰ型可以被改造的核酶RNaseP抑制及其与人巨细胞病毒的共感染研究

发布时间：2020-10-15 08:28

　　 人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)被认为是引起人获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的最原始病原体,它是一种感染人体免疫系统细胞的逆转录病毒。本文主要研究核酶RNase P对HIV感染复制的影响和HIV与HCMV共感染这两方面的内容。 使用一种体外筛选程序,我们已经筛选到一系列核酶RNase P的突变体,它们在体外可以高效的切割mRNA序列。在本研究中,我们选择了一个突变体——它针对HIV-1的RNA序列位于基因tat区域内。这个突变体核酶在体外切割tat RNA序列的效率比野生型核酶高20倍。这个核酶RNase P突变体的催化活性RNA来源于大肠杆菌,83位和340位核苷酸发生了突变(G83→U83，G340→A340)，我们的实验结果第一次直接证明了这种组合突变提高了核酶切割HIV-1的RNA序列的活性。而且,在细胞内,这种突变体核酶比野生型核酶更有效的降低了HIV-1核心蛋白p24的表达和细胞内病毒RNA的水平。在稳定表达这种突变体核酶的细胞内,病毒RNA的水平下降了90%,病毒的生长水平下降了150倍；而在没有表达核酶或者表达催化活性位点失去活力的核酶的细胞内,病毒RNA的水平下降不到10%。因此,我们认为基因工程改造的核酶突变体可以有效的抑制HIV的感染。这些实验结果也表明经过基因工程改造的核酶RNase P在抗HIV方面具有潜在的应用价值。 利用免疫共沉淀方法,验证由酵母双杂交筛选到的7个HIV病毒蛋白和7个HCMV病毒蛋白之间的12对相互作用,得到两对阳性结果,分别是tat-RLl和Nef-RLl。通过双荧光报告基因检测,我们发现RL1和tat以及RL1和Nef之间的相互作用并不影响HIV的LTR序列的转录活性。而RL1与pNL4-3. Luc. R-E-和pVSV-G·一起瞬时共转进293T细胞时,随着RL1量的增加,细胞培养基中HIV-1核心蛋白p24的表达量递增。我们通过酵母双杂交方法,筛选到与RL1相互作用的宿主细胞因子hnRNPK,免疫共沉淀和间接免疫荧光检测也证明它们之间可以相互作用；而文献报道hnRNPK调节HIV-1的tat/rev外显子3的剪切过程,对HIV-1有一定的抑制作用。此外,RL1和hnRNPK一起瞬时共转进293T细胞时,hnRNPK的表达量会随着加入RL1的量增加而递减。所以,在HIV和HCMV共感染时,我们推测HCMV可以通过RL1作用于hnRNPK促进HIV-1的复制。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R373
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)
        1.1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型简介
        1.1.2 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型反式激活因子tat
        1.1.3 HIV-1感染的危害与治疗
    1.2 人巨细胞病毒(HCMV)
        1.2.1 人巨细胞病毒的简介
        1.2.2 人巨细胞病毒的感染复制周期
        1.2.3 人巨细胞病毒的基因表达
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验中使用的基本仪器、设备
    2.2 基本实验试剂
    2.3 常规分子克隆实验技术
        2.3.1 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备
        2.3.2 大肠杆菌DH5α电转感受态的制备
        2.3.3 大肠杆菌DH5α感受态的使用
        2.3.4 SDS碱裂解法小量抽提质粒DNA
        2.3.5 Northern Blot实验
        2.3.6 PCR和限制性酶切
        2.3.7 定点突变PCR
    2.4 酵母双杂交系列实验
        2.4.1 cDNA文库的滴定和扩增
        2.4.2 酵母双杂交所用培养基
        2.4.3 酵母感受态的制备以及酵母转化
        2.4.4 酵母质粒提取
        2.4.5 酵母双杂交筛选文库
        2.4.6 X-gal显色实验
    2.5 细胞水平实验
        2.5.1 细胞培养基及试剂
        2.5.2 细胞培养(以HFF细胞为例)
        2.5.3 磷酸钙法转染细胞(以293T细胞为例)
        2.5.4 脂质体法转染细胞(以Lipofectine2000转染Hela细胞为例)
    2.6 体外蛋白质检测实验
        2.6.1 PAGE电泳和Western Blot检测
        2.6.2 免疫共沉淀实验
        2.6.3 间接免疫荧光实验
    2.7 病毒水平实验
        2.7.1 感染HFF细胞、扩增HCMV
        2.7.2 测定HCMV的病毒滴度
第三章 基因工程改造的核酶RNase P可以有效抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型的复制
    3.1 概述
    3.2 实验过程和结果
        3.2.1 核酶RNase P的构建以及其在体外切割HIV-1的tat基因RNA序列的特性研究
        3.2.2 人细胞内瞬时表达核酶RNase P抑制HIV-1的基因表达和复制
        3.2.3 人细胞内稳定表达核酶RNase P抑制HIV-1病毒的产生
    3.3 分析与讨论
第四章 人巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒Ⅰ型间蛋白相互作用的研究
    4.1 概述
    4.2 实验过程和结果
        4.2.1 HIV-1和HCMV病毒蛋白相互作用的Co-IP验证
        4.2.2 HCMV病毒蛋白RL1相关的研究
        4.2.3 HCMV病毒蛋白RL1与HIV-1的Nef蛋白和tat蛋白相互作用对LTR转录活性的影响
        4.2.4 HCMV病毒蛋白RL1与宿主蛋白hnRNPK相互作用的验证
        4.2.5 HCMV病毒蛋白RL1与宿主蛋白hnRNPK相互作用对HIV-1基因表达的影响
    4.3 分析与讨论
参考文献
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致谢

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本文编号：2841937