构建Gab1特异RNAi慢病毒载体及其对人血管内皮细胞增殖影响的研究

发布时间：2017-06-16 14:01

  本文关键词：构建Gab1特异RNAi慢病毒载体及其对人血管内皮细胞增殖影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 构建针对人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Grb2-AssociatedBinder1，Gab1）基因的慢病毒干扰载体，从转录后水平抑制Gab1基因的表达，并将构建的慢病毒RNA干扰载体载染人血管内皮细胞，研究沉默细胞内Gab1基因表达后对细胞增殖能力的影响。 方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的SiRNA序列，并分别合成靶序列的Oligo DNA，，退火形成双链DNA，与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接，产生Gab1 RNAi重组质粒，PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将各个靶点的重组质粒与构建的Gab1过表达质粒共转染293T细胞，通过Western bolt检测Gab1蛋白表达水平来筛迁最佳干扰靶点的重组质粒，再将最佳的Gab1 RNAi重组质粒、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染239T细胞，包装产生LV Gab1 RNAi慢病毒并测定其滴度。并将获得的慢病毒分别载染EA.hy926细胞，通过荧光显微镜观察GFP的表达情况，测定其转染效率；通过RT PCR和Western bolt检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1mRNA和蛋白表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率。将构建好的慢病毒干扰载体载染EA.hy926细胞，在细胞接种后第1、2、3、4、5d利用MTT分析方法检测其对细胞增殖的影响。 结果 1、筛选阳性克隆经ＰＣＲ及测序鉴定，成功将Gab1靶向含shRNA的双链DNA 序列插入GV118载体中即Gab1 RNAi重组质粒构建成功。 2、包装产生的LV Gab1 RNAi慢病毒载染293T细胞，测定的滴度为3×109TU/ml。 3、RT-PCR和Western Blot检测RNAi慢病毒载染后的血管内皮细胞中目的基因 表达水平，证实构建的慢病毒干扰载体可以高效抑制Gab1基因的表达。 4、沉默血管内皮细胞中Gab1基因表达后，细胞增殖受到明显的抑制。 结论 构建的特异RNAi慢病毒能够高效载染血管内皮细胞，并且细胞内Gab1目的基因mRNA和蛋白的表达水平显著降低，可为研究基因沉默前后血管内皮细胞生物学行为的改变和探讨Gab1基因在血管新生中的作用提供有效技术手段；Gab1基因在促进细胞增殖方面有重要作用。
【关键词】：Gab1 RNA干扰 慢病毒载体 基因载染 血管内皮细胞 细胞增殖
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 主要英文缩略索引4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 引言10-12
• 第一部分 Gab1 基因特异 RNAi 慢病毒载体的构建12-41
• 材料和方法12-29
• 结果29-37
• 讨论37-41
• 第二部分 RNAi 慢病毒载体的内源验证及对 EA.hy926 细胞增殖的影响41-53
• 材料和方法41-46
• 结果46-50
• 讨论50-53
• 结论53-54
• 参考文献54-59
• 致谢59-60
• 综述60-65
• 参考文献63-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 姜秋红;高惠君;姚树人;;肿瘤新生血管生成抑制剂的研究进展[J];中国临床药学杂志;2009年03期

2 胥传飞;卢晟盛;王友亮;杨晓;;接头蛋白Gab1的结构及功能研究进展[J];生物技术通讯;2009年06期

3 温绍君,王金城,张忱,张文,文杰,王佐广,刘洁琳,周其文;冠脉搭桥围手术期肿瘤坏死因子和内皮素的动态变化及意义[J];中华医学杂志;2001年23期

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本文编号：455526