HDAC8调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

发布时间：2017-06-22 21:11

  本文关键词：HDAC8调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种能够分化为成骨细胞、成软骨细胞或成脂细胞的多潜能干细胞。由于易于获取且免疫反应小等特点，临床上利用BMSCs进行骨缺损的修复逐渐成为研究者关注的焦点，目前对于BMSCs修复骨缺损能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力。最近研究发现组蛋白去乙酰化酶（HDACs）家族的许多成员在BMSCs成骨分化过程中发挥重要调控作用，本实验检测HDAC8对BMSCs成骨分化能力的影响，并进一步探索HDAC8在BMSCs成骨分化过程中的调控机制，为将来临床骨缺损再生修复提供实验依据。 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及生物学特性鉴定 目的：体外提取并培养大鼠BMSCs，对大鼠BMSCs的生物学特性进行鉴定。 方法：利用全骨髓贴壁法体外提取并培养大鼠BMSCs，三天后换液除去造血细胞等未贴壁细胞，待细胞形成单克隆集落并且当各集落相互接触时进行传代培养；通过克隆形成率分析、MTT分析、流式细胞周期分析对BMSCs的增殖能力进行鉴定；通过流式细胞仪对BMSCs表面抗原进行检测；通过矿化诱导、成脂诱导液培养BMSCs并进行油红O染色、茜素红钙结节染色检测BMSCs的多向分化能力。 结果：稳定培养的BMSCs呈纺锤形，细胞胞体丰满，胞核较大，呈漩涡分布；体外培养的BMSCs具有较强的自我增殖能力且不易分化；经流式表面抗原标记检测，BMSCs中CD29阳性表达，造血干细胞标记CD34阴性表达；经过矿化诱导及成脂诱导后，BMSCs能够向成骨细胞及脂肪细胞定向分化，具有多向分化潜力。 结论：本实验通过全骨髓贴壁培养法获得BMSCs，体外培养的细胞呈贴壁的纺锤体样旋涡状生长，具有自我增殖的能力，表面抗原干细胞标记阳性表达，能够在诱导下多向分化，具有干细胞特性，为后续实验奠定了基础。 第二部分：HDAC8对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 目的：检测大鼠BMSCs成骨分化过程中HDAC8的表达规律，研究HDAC8在BMSCs成骨分化过程中所发挥的作用。 方法：1、Western blot及免疫荧光细胞化学检测BMSCs成骨分化过程中HDAC8的表达规律；构建HDAC8过表达慢病毒载体并转染大鼠BMSCs，实时定量PCR及Western blot检测转染效率；MTT检测转染后BMSCs的增殖情况；碱性磷酸酶活性测定、茜素红钙结节染色、Western blot及实时定量PCR检测矿化诱导7天后BMSCs成骨能力的变化。2、加入1mM VPA后，，Western blot检测BMSCs中HDAC8的表达，MTT检测BMSCs的增殖情况，茜素红矿化结节染色、Westernblot及实时定量PCR检测BMSCs成骨能力的变化；HDAC8-siRNA化学干扰试剂转染BMSCs，Western blot及实时定量PCR检测转染效率及矿化诱导7天后BMSCs成骨能力的变化；转染HDAC8过表达慢病毒载体的BMSCs中加入1mM VPA，实时定量PCR及Western blot检测矿化诱导7天后过表达HDAC8的BMSCs成骨能力的变化。 结果：1、BMSCs成骨分化过程中HDAC8表达呈递减趋势；HDAC8过表达慢病毒载体转染BMSCs后倒置荧光显微镜观察转染效率，大部分BMSCs表达绿色荧光，HDAC8蛋白水平及mRNA水平明显上调，转染后BMSCs的增殖能力未见明显改变；矿化诱导7天后转染HDAC8过表达慢病毒载体的BMSCs成骨相关基因表达下降且矿化结节形成能力下降。2、加入1mM VPA后，BMSCs的HDAC8在24小时内表达逐渐下降，且BMSCs的增殖能力有所下降，矿化诱导7天后BMSCs的成骨相关基因表达增强且矿化结节形成能力增强；转染HDAC8-siRNA化学干扰试剂后BMSCs的HDAC8表达明显降低，矿化诱导7天后其成骨能力有所增强；转染HDAC8过表达慢病毒载体的BMSCs中加入1mM VPA后经矿化诱导，成骨相关基因的表达均有增强。 结论：HDAC8对大鼠BMSCs成骨分化具有抑制作用。 第三部分：HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化过程中的调控机制 目的：检测大鼠BMSCs成骨分化过程中组蛋白H3K9乙酰化水平的变化规律，研究组蛋白H3K9、HDAC8与RUNX2的相互作用，进一步探索HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化过程中的调控机制。 方法：Western blot及免疫荧光细胞化学检测BMSCs成骨分化过程中组蛋白H3K9乙酰化水平的变化规律；Western blot检测过表达HDAC8的BMSCs及抑制或干扰HDAC8的BMSCs中组蛋白H3K9的乙酰化水平；ChIP检测矿化诱导前后RUNX2启动子区组蛋白H3K9的乙酰化水平变化；co-IP检测矿化诱导前后HDAC8与RUNX2的相互作用。 结果：BMSCs成骨分化过程中组蛋白H3K9的乙酰化水平逐渐增强；HDAC8过表达的BMSCs中组蛋白H3K9的乙酰化水平下降，而HDAC8受到抑制或者干扰的BMSCs中组蛋白H3K9的乙酰化水平有所提高；ChIP结果显示矿化诱导后RUNX2启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平较诱导前高，co-IP结果显示HDAC8与RUNX2在此次免疫共沉淀中均有表达，并且在矿化诱导后RUNX2结合的HDAC8蛋白水平较诱导前有所下降。 结论：HDAC8一方面通过直接与成骨关键调控因子RUNX2结合，抑制BMSCs的成骨分化；另一方面通过调节组蛋白H3K9乙酰化水平间接调控RUNX2的转录从而抑制BMSCs成骨分化。
【关键词】：组蛋白去乙酰化酶8 runt-相关转录因子2 骨髓间充质干细胞 成骨分化 组蛋白H3K9乙酰化
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 英文缩略词表7-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养和生物学特性鉴定18-32
• 材料和方法18-23
• 结果23-29
• 讨论29-31
• 小结31-32
• 第二部分 HDAC8 对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响32-64
• 第一节 HDAC8 过表达载体的构建及其对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响32-54
• 材料和方法32-46
• 结果46-54
• 第二节 HDAC8 抑制对大鼠 BMSCs 成骨分化的影响54-61
• 材料和方法54-55
• 结果55-61
• 讨论61-63
• 小结63-64
• 第三部分 HDAC8 在大鼠 BMSCs 成骨分化过程中的调控机制64-77
• 材料和方法64-70
• 结果70-74
• 讨论74-76
• 小结76-77
• 全文总结77-79
• 参考文献79-84
• 综述84-98
• 参考文献92-98
• 攻读学位期间发表文章情况98-99
• 致谢99

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 夏靖;冯冰虹;;组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的研究进展[J];广东药学院学报;2010年05期

2 周荣睿;李江;;组蛋白乙酰化与头颈部恶性肿瘤[J];国际口腔医学杂志;2007年06期

3 孙开胜,徐克前;组蛋白乙酰化/去乙酰化与基因表达调控[J];生命科学研究;2004年S1期

  本文关键词：HDAC8调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：473107