共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPS细胞分化

发布时间：2017-07-01 05:10

  本文关键词：共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPS细胞分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分CdSe/ZnS核/壳结构量子点用于标记人诱导多能干细胞 目的：探讨CdSe/ZnS核/壳结构量子点标记体外培养人诱导多能干细胞的可行性及其荧光强度和光稳定性。 方法：用无饲养层细胞培养法培养扩增UMC-人iPS细胞系，根据细胞的生长情况及形态辨别周边少数自然分化的细胞，在严格无菌条件下人工挑取后用一次性输液管移除，并用Western blot及免疫荧光检测法对其干细胞特性进行鉴定；选取配制5nmol/L、7.5nmol/L和10nmol/L三种不同浓度CdSe/ZnS核/壳结构的量子点对传代扩增的人iPS细胞进行标记，，用活细胞三维去卷积成像系统观察标记效果；量子点标记后的人iPS细胞继续培养，倒置相差显微镜观察细胞的贴壁、生长、形态等情况，分别于1次传代后1w和2次传代后1w观察荧光的稳定性。 结果:倒置相差显微镜观察到无饲养层细胞培养法培养扩增的人iPS细胞以小克隆样贴壁生长，人工挑取结合一次性输液管移除自然分化细胞，细胞克隆可持续维持未分化状态生长且逐渐融合成大克隆，Western blot及免疫荧光检测均显示iPS细胞中OCT4和Nanog两种干细胞标志蛋白表达阳性；5nmol/L、7.5nmol/L和10nmol/L三种浓度的量子点应用液均可标记iPS细胞，浓度为10nmol/L量子点的标记效果呈现出最明亮的橘红色荧光；标记后的iPS细胞传代后在贴壁、生长、扩增和形态上无明显变化，2次传代后1w用活细胞三维去卷积成像系统仍可在细胞克隆中观察到量子点荧光，与传代前和1次传代后1w相比荧光强度减弱。 结论: CdSe/ZnS核/壳结构量子点可用于标记示踪人iPS细胞，在10nmol/L浓度内荧光标记呈浓度正相关依赖，本实验条件下量子点荧光至少可达2w，为iPS细胞在混合接触共培养体系的诱导分化以及体内细胞研究的实时动态监测提供了优化的标记示踪工具。 第二部分共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPS细胞分化 目的:观察人诱导多能干细胞与兔角膜内皮细胞混合接触和插入式间接接触共培养前后的形态学变化，检测共培养前后人iPS细胞的部分标志蛋白表达变化，初步探讨iPS细胞向角膜内皮样细胞分化的潜能。 方法:对实验动物取材的角膜组织内皮细胞层进行茜素红染色，快速胰酶消化法分离兔原代CECs，培养至足够数量后常规消化传代。无饲养层细胞法培养扩增UMC-人iPS细胞系，至生长融合90%以上时消化，将1/2、1/3、1/4的iPS细胞悬液，加入到CECs中进行混合接触共培养，倒置相差显微镜观察细胞共存与相互影响情况并确定最佳细胞密度比例，1w后用原子力显微镜（AFM）观测共培养前后人iPS细胞的形态学变化。量子点标记人iPS细胞，以最佳密度比例建立人iPS细胞与兔CECs的混合接触共培养体系，2w后用免疫荧光法检测人iPS细胞分化前后的CD34、CD133、CD31和AQP1四种蛋白表达变化。另外，消化人iPS细胞以1:4、1:5、1:6传代至Transwell小室中，插入生长有60%融合状态的第一代兔CECs的6孔板中，倒置显微镜观察细胞共存与相互影响情况并确定最佳细胞密度比例，插入式间接接触共培养2w后免疫荧光法检测人iPS细胞分化后上述四种蛋白表达情况。 结果:兔角膜组织的CECs茜素红染色阳性呈六角形结构，细胞间紧密排列；培养扩增的兔CECs也具有六角形细胞形态，呈典型的铺路石样外观。混合接触共培养体系最佳细胞密度比例为1/4iPS细胞悬液+60%兔CECs，即10nmol/L量子点标记的人iPS细胞以1/4悬液与融合60%的兔CECs为最佳模型，两种细胞能共同生存且相互影响；AFM（所选参数：细胞的二维和三维全貌、细胞直径、核直径以及近核处5um小区域细胞膜的均方根粗糙度和平均粗糙度）结合倒置显微镜观察到混合接触共培养后人iPS细胞体积增大，胞浆增多，核浆比减小，细胞膜表面凹陷结构增多且加深加宽，突起结构增多增高如指状，膜表面均方根和平均粗糙度均增加，这些结果均向CECs靠近。1:5传代的iPS细胞可以最佳状态与60%兔CECs进行间接共培养，倒置显微镜下观察人iPS细胞向多种形态细胞分化，无规律无方向。免疫荧光法检测共培养前iPS细胞的CD34、CD133、CD31和AQP1表达均呈阴性，混合接触共培养2w后人iPS细胞CD34、CD133、CD31表达阴性，AQP1表达呈阳性；间接接触共培养2w后人iPS细胞上述4种蛋白表达均显示阴性。 结论:共培养环境可诱导人iPS细胞从形态学上及部分标志蛋白表达上向CECs方向分化，细胞密度比例、共培养时间的长短、细胞因子的沟通交流、细胞的直接接触等是诱导分化的重要因素。本研究为iPS细胞分化为CECs的研究奠定了基础并提供了有益的实验依据。
【关键词】：量子点 诱导多能干细胞 标记 示踪 诱导多能干细胞 角膜内皮细胞 共培养 原子力显微镜 分化
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-23
• 1 细胞共培养体系10-13
• 1.1 细胞共培养的应用基础10
• 1.2 细胞共培养体系建立的方法10-12
• 1.3 细胞共培养在组织工程中的应用12-13
• 2 诱导多能干细胞13-18
• 2.1 诱导多能干细胞的诱导14
• 2.2 诱导多能干细胞的应用14-18
• 3 量子点荧光探针18-21
• 3.1 量子点简介18-19
• 3.2 量子点荧光探针的应用19-21
• 4 原子力显微镜技术21-22
• 4.1 原子力显微镜简介21
• 4.2 原子力显微镜在生物医学中的应用21-22
• 5 本实验研究的目的、内容与意义22-23
• 第一部分 CdSe/ZnS 核/壳结构量子点用于标记人诱导多能干细胞23-35
• 1 引言23
• 2 实验材料与方法23-27
• 2.1 主要实验试剂23-24
• 2.2 主要实验仪器24-25
• 2.3 主要试剂的配制25-26
• 2.4 实验方法26-27
• 3 结果27-28
• 4 讨论28-31
• 5 附图31-35
• 第二部分 共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人 iPS 细胞分化35-53
• 1 引言35
• 2 实验材料与方法35-41
• 2.1 主要实验试剂35-36
• 2.2 主要实验仪器36-37
• 2.3 主要试剂的配制37-38
• 2.4 实验分组38
• 2.5 细胞准备38-39
• 2.6 人 iPS 细胞与兔 CECs 混合接触共培养39
• 2.7 人 iPS 细胞的量子点标记39-40
• 2.8 人 iPS 细胞与兔 CECs Transwell 间接共培养40
• 2.9 原子力显微镜观察40
• 2.10 免疫荧光检测40-41
• 3 结果41-44
• 3.1 茜素红染色41
• 3.2 兔 CECs 的生长情况41
• 3.3 倒置相差显微镜观察41-43
• 3.4 原子力显微镜观察43
• 3.5 免疫荧光检测43-44
• 4 讨论44-48
• 5 附图48-53
• 参考文献53-63
• 全文结论63-64
• 问题与展望64-65
• 主要英文缩略词65-66
• 在校期间发表的论文66-67
• 致谢67

【参考文献】

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本文编号：504663