绿僵菌染色体核型分析及其侵染相关基因的FISH分析

发布时间：2017-07-01 05:22

  本文关键词：绿僵菌染色体核型分析及其侵染相关基因的FISH分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：真菌是一种真核生物，具有细胞壁和真正的细胞核，不含叶绿素，以寄生或者腐生的方式生存；典型真菌兼有有性生殖和无性生殖，并产生各种形态具有繁殖能力的孢子。真菌与人类的健康有着莫大的关系：青霉菌产生的青霉素可以治疗细菌感染，与此同时，真菌也会对人类的健康带来威胁，数据分析，对人类有致病性的真菌约有300多个种类，例如念珠菌引起的婴儿念珠菌肠炎、毛癣菌引起的手足癣等都是由于真菌感染所引起；近年来，随着高效广谱抗生素、免疫抑制剂、抗恶性肿瘤药物的广泛应用，器官移植、导管技术以及外科其他介入性治疗的深入开展，病原真菌引起的系统性真菌感染也日益增多，新出现的致病菌使病情也日趋严重，因此开发新的抗真菌药物就成了当务之急。 绿僵菌是一种以昆虫为宿主的丝状真菌，由于其遗传背景已经研究清楚，并且对人、畜以及环境都无害，因此可以作为真菌侵染和致病机理研究的理想生物。如果对抗真菌药物进行研究和开发，，就必须对真菌的侵染和致病机制进行研究；虽然目前已经对真菌部分与侵染有关的基因进行了初步研究，如Pr1和Pr2蛋白酶基因，它们对真菌的侵染能力具有一定的调控作用，但是这些基因并不是单独发挥作用，而是通过协同作用而达到完成侵染的过程，并产生生物学效应。明确侵染相关基因在染色体上的位置有助于了解、研究这些基因表达调控的模式及其在功能上的相关性，为从整体基因水平上研究真菌的侵染机制奠定基础，也为将来研发阻断真菌侵染的抗真菌药物提供理论依据。 染色体核型分析是研究基因及功能基因组的基础。只有在核型分析完成的基础上才可以进行DNA标记和目的基因定位；目前对真菌的核型分析难度较大，由于真菌染色体较小，长度较短，着丝粒、随体等特征标记都很难通过显微镜观察到，已有的针对真菌核型研究的方法主要有有传统光学显微镜观察法以及脉冲凝胶电泳法（PFGE）两种，由于真菌染色体较小，因此通过传统光学显微镜对真菌进行观察时都选用处于分裂中期的细胞，这样才能在显微镜下分辨每条染色体，尽管如此也常常会低估真菌染色体的数目；脉冲凝胶电泳法由于其快速高效的检测特点而被广泛应用于不同物种染色体核型的分析，但它也有一定的局限性，比如无法直接观察到染色体的形态，凝胶电泳只能分离10kb到10Mb大小的染色体，并且当多条染色体的大小很接近时通过脉冲凝胶电泳无法将其分离开来从而低估染色体的数目。采用光学显微镜法进行核型分析的真菌有Neurospora crassa，Tuber aestivum，Erysiphe graminis，Erysiphe，Penicillium chrysogeum等；采用脉冲凝胶电泳法进行核型分析的真菌有Nectria haematococca、Cochliobolus heterostrophus、Botrytos、Rhizoctonia solani等；因此对绿僵菌的核型研究和相关基因的定位将为该领域的研究提供新的研究方法和理论补充。 本研究以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株CQMa102为研究对象，通过构建Pgpd-H1-GFP表达载体并在绿僵菌体内表达从而可以对其有丝分裂行为进行活体动态观察,并为核型分析提供一定的研究价值；使用改良的胚芽管爆裂制片法对绿僵菌进行染色体制片，通过传统光学显微镜观察染色体并进行核型分析，以及通过荧光原位杂交技术（FISH）对核糖体RNA（rDNA）在绿僵菌染色体上的定位进行了分析，得出结论如下： 1Ma102绿僵菌有丝分裂行为的动态活体观察 1.1Pgpd-H1-GFP表达载体的构建并成功转入绿僵菌 在带有抗除草剂Bar（抗草铵膦）基因的PK2-PB-EGFP载体基础上我们分别插入了组成型启动子Pgpd片段和表达组蛋白H1片段，通过PCR、酶切和测序验证确定重组Pgpd-H1-GFP载体成功构建；再通过农杆菌介导转化的方法使Pgpd-H1-GFP成功转入绿僵菌体内并稳定表达。 1.2筛选绿僵菌H1-GFP表达菌株，对其有丝分裂行为进行活体动态观察 通过荧光显微镜的观察证实H1-GFP在绿僵菌体内成功表达。H1-GFP定位于细胞核的染色体上，从而使染色体带上可以识别的荧光标记。利用该转化菌株可以对绿僵菌有丝分裂过程进行动态观察；随着显微成像技术的提高，我们可以实现活体状态下对绿僵菌染色体条数的统计和观察，为绿僵菌染色体核型分析提供有力直接的依据。 2Ma102染色体核型分析 2.1Ma102染色体标本制备方法的改进 通过优化酸处理时间及增加低渗等步骤，得出绿僵菌染色体核型标本制作方法如下：选取新鲜绿僵菌孢子使用1/4SDA液体培养基培养8-10h，待孢子萌发长出胚芽后进行离心收集并使用甲醇和冰乙酸（V/V=17:3）进行固定过夜，再分别使用无水乙醇和70%乙醇进行固定，固定时间分别为2h；使用盐酸解离法对绿僵菌细胞壁进行处理，处理条件为1M HCl60℃水浴处理8-14min；使用预冷的1×PBS低渗20min；烤片后使用吉姆萨或者DAPI进行染色，染色时间分别为30min和10min。 2.2显微镜观察Ma102绿僵菌染色体并对其进行核型分析 显微镜下对绿僵菌染色体进行观察，对60个清晰的核型标本进行了统计分析，得出Ma102绿僵菌染色体的平均数目为10条，Ma102绿僵菌染色体染色体平均相对长度分别为16.3%、13.4%、12.7%、11.3%、9.9%、8.9%、8.2%、7.2%、6.3%、5.7%。根据每条染色体的相对长度绘制其核型模式图，通过观察发现Ma102分裂前期染色体相对较长，并且在部分染色体照片中可以观察到某条染色体的着丝点及随体等结构。 3绿僵菌rDNA的荧光原位杂交（FISH）分析 rDNA在绿僵菌染色体上进行荧光原位杂交 根据Roche公司试剂盒说明书和西南大学实验室原位杂交流程，采用缺口平移法制备rDNA探针并与绿僵菌染色体标本进行杂交，通过一系列洗脱及信号检测处理，最终通过荧光显微镜观察到杂交信号，并拍照记录和数据分析,为以后侵染相关基因的定位奠定理论基础。
【关键词】：绿僵菌 染色体 核型分析 H1组蛋白 绿色荧光蛋白 rDNA 荧光原位杂交
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 缩略词13-14
• 1 绪论14-23
• 1.1 引言14
• 1.2 研究背景14-18
• 1.2.1 真菌染色体核型分析的研究14-17
• 1.2.2 有丝分裂行为动态观察的研究17-18
• 1.2.3 荧光原位杂交技术的研究18
• 1.3 课题的立题依据与实验目的18-19
• 1.3.1 立题依据18-19
• 1.3.2 实验目的19
• 1.4 本课题研究内容19-20
• 1.4.1 绿僵菌染色体的核型分析19-20
• 1.4.2 Pgpd-H1-GFP 表达载体的构建20
• 1.4.3 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌阳性转化子的获得20
• 1.4.4 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌有丝分裂行为观察20
• 1.4.5 荧光原位杂交20
• 1.5 技术路线20-21
• 1.5.1 绿僵菌 H1-GFP 融合表达菌株的构建及其有丝分裂行为的动态观察20-21
• 1.5.2 改进的染色体制片方法与绿僵菌核型分析21
• 1.5.3 绿僵菌 Ma102 的 rDNA 荧光原位杂交21
• 1.6 本课题创新之处21-23
• 2 绿僵菌 H1-GFP 融合表达菌株的建立及其有丝分裂行为的动态观察23-37
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 实验所用菌株23
• 2.1.2 主要培养基及配制方法23
• 2.1.3 实验所需主要试剂23-24
• 2.1.4 主要实验试剂的配制24
• 2.1.5 主要设备24-25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 真菌基因组的大量提取25
• 2.2.2 Pgpd-H1-GFP 载体的构建25-30
• 2.2.3 电激转化农杆菌30-31
• 2.2.4 农杆菌介导的绿僵菌转化实验31
• 2.2.5 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌阳性转化子的鉴定31-32
• 2.2.6 荧光显微观察 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌的有丝分裂行为32
• 2.3 结果与分析32-36
• 2.3.1 Pgpd 和 H1 目的基因片段的克隆32-33
• 2.3.2 Pgpd-H1-GFP 质粒的鉴定33
• 2.3.3 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌阳性克隆的鉴定33-34
• 2.3.4 Pgpd-H1-GFP/绿僵菌阳性转化子的显微观察34-35
• 2.3.5 H1-GFP 在绿僵菌有丝分裂中的行为观察35-36
• 2.4 实验讨论36-37
• 3 绿僵菌染色体核型分析37-47
• 3.1 实验材料37-38
• 3.1.1 实验所用菌株37
• 3.1.2 主要培养基及配制方法37
• 3.1.3 实验所需主要试剂37
• 3.1.4 主要实验试剂的配制37
• 3.1.5 主要设备37-38
• 3.2 实验方法38-39
• 3.2.1 菌丝的固定38
• 3.2.2 改良的胚芽管爆裂制片（GTBM）38-39
• 3.2.3 图像采集与核型分析39
• 3.3 结果与分析39-45
• 3.3.1 载玻片上原生质体的制备39-40
• 3.3.2 染色体的显微观察40-41
• 3.3.3 绿僵菌染色体条数统计41
• 3.3.4 核型分析41-44
• 3.3.5 核型模式图44-45
• 3.4 实验讨论45-47
• 4 绿僵菌 rDNA 荧光原位杂交47-54
• 4.1 实验材料47-48
• 4.1.1 实验所用菌株47
• 4.1.2 主要培养基及配制方法47
• 4.1.3 实验所需主要试剂47
• 4.1.4 主要实验试剂的配制47-48
• 4.1.5 主要设备48
• 4.2 实验方法48-51
• 4.2.1 rDNA 片段的获取48-49
• 4.2.2 缺口平移法制作 rDNA 探针49
• 4.2.3 抗地高辛抗原结合片段的制备49
• 4.2.4 荧光原位杂交49-51
• 4.3 结果与分析51-53
• 4.3.1 rDNA PCR 扩增结果51-52
• 4.3.2 rDNA 探针的制备52
• 4.3.3 荧光原位杂交52-53
• 4.4 实验讨论53-54
• 5 主要结论54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-60
• 附录 160-63
• 附录 263

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：504746