筛选携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体
本文关键词：筛选携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体
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【摘要】：目的：筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠（SHR）阴茎海绵体平滑肌细胞内Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho-associatedcoiled-coil containing protein kinase2，ROCK2）基因表达的携带siRNA的慢病毒载体。方法：1.采用组织块贴壁培养法分离培养SHR阴茎海绵体平滑肌细胞。2.靶向大鼠ROCK2基因设计具有基因特异性的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，，构建其短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组慢病毒表达载体。①设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Hpa I、XhoI进行酶切后的GP-Supersilencing Vector载体连接产生shRNA慢病毒载体。②转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。③GP-Supersilencing Vector与三种混合包装质粒共转染293T细胞，包装产生shRNA重组慢病毒。3.随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌细胞分为6组（每组n=5），每组每个样本3×104个细胞，分别为：A组（未转染对照组）、B组（携带慢病毒转染组）、C～F组（分别携带靶向ROCK2基因的siRNA1～4号靶点的慢病毒转染组），以MOI=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞，转染后48小时荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2基因mRNA的表达。结果：1.经酶切及基因测序鉴定证实重组慢病毒载体质粒构建成功。2.荧光显微镜下观察各组细胞感染效率均大于50%。3.RT-PCR方法检测转染后各组ROCK2mRNA的表达：与A组相比，B组ROCK2基因mRNA的表达无明显改变（P㧐0.05）；C组、D组、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降（P0.01），抑制效率分别达到43.91±8.19!、47.15±6.64!、25.7±6.03!；E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显著下降（P0.05），抑制效率为16.81±5.94!。结论：1.本研究成功构建了大鼠ROCK2基因RNAi慢病毒载体，为后续的改善SHR勃起功能的体内外实验奠定了基础。2.构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达，其中有3种慢病毒载体抑制作用较强。
【关键词】：SHR大鼠 ROCK2 RNA干扰 靶点筛选
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-9
- 前言9-11
- 材料与方法11-31
- 结果31-39
- 讨论39-41
- 结论41-42
- 参考文献42-45
- 英汉缩略词对照表45-46
- 致谢46-47
- 综述47-60
- 参考文献56-60
【参考文献】
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本文编号：600435
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