花生过敏重组乳酸菌口服疫苗的制备及其效果的评价

发布时间：2017-08-15 08:15

  本文关键词：花生过敏重组乳酸菌口服疫苗的制备及其效果的评价

  更多相关文章： 乳酸菌 花生过敏 口服疫苗 重组表达

【摘要】：花生过敏是一种常见的食物过敏，具有发病率高、临床症状严重和危险性高的特点，不易产生免疫耐受。目前避免接触含有花生过敏原的食物是防治花生过敏的唯一途径，因此寻求一种安全有效的预防花生过敏的方法具有重要意义。乳酸菌被公认为是安全的食品级微生物，部分菌株防治过敏性疾病的作用已获得了肯定，利用乳酸菌表达各种抗原以制备口服疫苗的研究日益受到人们的关注。本文以乳酸菌作为宿主菌株表达花生过敏原Ara h2.02，旨在研究探索一种安全、有效、方便的新型花生过敏口服疫苗。 本文首先通过小鼠模型，研究干酪乳杆菌（Lactobacillus casei Zhang）在抗花生过敏方面的作用。动物实验结果表明，口服L. casei Zhang进行预防或治疗处理后，小鼠花生过敏症状显著减轻，血清中总IgE、特异性IgE和MCP-1的水平明显降低，粪便中组胺的含量下降，而血清特异性IgG2a和黏膜总IgA水平有所上升。体外细胞刺激实验表明，L. casei Zhang能显著降低Th2细胞的反应，减少IL-4的分泌，而对IL-12以及IFN-γ的表达水平并没有明显的影响，但IFN-γ/IL-4的比例显著增加。这些结果表明，L. casei Zhang能促使Th2优势反应向Th1反应转变，具有明显的免疫调节功能，从而起到预防和治疗花生过敏反应的作用。 为了得到纯化的Ara h2.02蛋白及anti-Ara h2.02多克隆抗体用于后续Western blot实验，本研究构建含有密码子优化的nAra h2.02基因的大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-nh2，并转化E. coli BL21（DE3），以IPTG诱导表达。表达的His-Ara h2.02蛋白经镍柱亲和层析纯化后，目的蛋白纯度为85%，将其用于免疫兔子得到效价为1:50000的多克隆抗体。 为降低天然过敏原在免疫治疗中诱发过敏反应的风险，本文对nAra h2.02基因进行了序列重排及定点突变，得到低过敏原性的mAra h2.02基因。采用L. casei Zhang作为宿主菌株构建口服疫苗，但结果表明nAra h2.02和mAra h2.02基因在L. casei Zhang中表达不成功。而乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为乳酸菌的模式菌，常被用作宿主菌株表达外源蛋白。因此选择L. lactis NZ9000作为宿主菌株，重新构建花生过敏口服疫苗。将乳酸乳球菌表达载体pNZ-nh2和pNZ-mh2电击转化L. lactis NZ9000后，成功地诱导表达了目标蛋白。通过动物实验评价该口服疫苗，结果显示，重组乳酸菌口服疫苗能显著减轻小鼠花生过敏的症状，抑制小鼠体内Th2型过敏反应（总IgE、特异性IgE抗体、MCP-1、组胺以及IL-4细胞因子），，增加Th1型特异性IgG2a抗体水平，同时上调IFN-γ/IL-4的比例。这些结果表明，重组乳酸菌花生过敏口服疫苗，尤其是低过敏原性的重组菌，能抑制Th2反应，同时促进Th1反应，从而预防花生过敏。 综上所述，本研究成功构建了一种安全、有效的花生过敏口服疫苗，为花生过敏的预防提供了新的思路和方法。
【关键词】：乳酸菌 花生过敏 口服疫苗 重组表达
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 花生过敏9-13
• 1.1.1 花生过敏简介9-10
• 1.1.2 花生过敏原及其研究进展10-11
• 1.1.3 食物过敏的防治11-13
• 1.2 益生菌13-15
• 1.2.1 益生菌简介13
• 1.2.2 益生菌的功能13-14
• 1.2.3 益生菌对花生过敏的防治作用14-15
• 1.2.4 益生菌用作口服疫苗15
• 1.3 课题研究意义和内容15-17
• 1.3.1 本课题研究意义15-16
• 1.3.2 主要研究内容16-17
• 第二章 Lactobacillus casei Zhang 对花生过敏的影响17-29
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 菌株17
• 2.1.2 培养基与培养条件17
• 2.1.3 实验动物17
• 2.1.4 主要试剂及试剂盒17-18
• 2.1.5 主要仪器与设备18
• 2.1.6 溶液的配制18-19
• 2.2 实验方法19-22
• 2.2.1 花生粗蛋白（CPE）的提取19
• 2.2.2 CPE 的 SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定19
• 2.2.3 菌株的培养19-20
• 2.2.4 动物实验20
• 2.2.5 花生过敏反应各项指标的检测20-22
• 2.2.6 数据处理22
• 2.3 结果与讨论22-28
• 2.3.1 花生粗蛋白的蛋白浓度及组分22
• 2.3.2 花生过敏症状的评分22-23
• 2.3.3 L. casei Zhang 对小鼠血清总 IgE 抗体的影响23-24
• 2.3.4 小鼠血清中特异性抗体的检测24-25
• 2.3.5 小鼠血清中 MCP-1 含量和粪便中组胺含量的检测25-26
• 2.3.6 L. casei Zhang 对小鼠粪便中总 IgA 抗体的影响26-27
• 2.3.7 体外细胞因子的检测27-28
• 2.4 本章小结28-29
• 第三章 Ara h 2.02 在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体的制备29-41
• 3.1 实验材料29-31
• 3.1.1 菌株与质粒29
• 3.1.2 培养基与培养条件29
• 3.1.3 工具酶与试剂29-30
• 3.1.4 主要仪器与设备30
• 3.1.5 溶液的配制30
• 3.1.6 PCR 引物30-31
• 3.2 实验方法31-34
• 3.2.1 Ara h 2.02 蛋白的信号肽预测31
• 3.2.2 Ara h 2.02 基因的密码子优化与合成31
• 3.2.3 大肠杆菌表达载体 pET-nh2 的构建31-33
• 3.2.4 Ara h 2.02 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中的表达及纯化33-34
• 3.2.5 重组蛋白制备多克隆抗体34
• 3.3 结果与讨论34-40
• 3.3.1 Ara h 2.02 蛋白的信号肽预测34-35
• 3.3.2 Ara h 2.02 基因的密码子优化35-36
• 3.3.3 大肠杆菌表达载体 pET-nh2 的构建36-38
• 3.3.4 Ara h 2.02 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中的诱导表达38-39
• 3.3.5 Ara h 2.02 蛋白的纯化及多克隆抗体的效价39-40
• 3.4 本章小结40-41
• 第四章 Ara h 2.02 在乳酸乳球菌中的表达及花生过敏重组乳酸菌口服疫苗的研究41-60
• 4.1 实验材料41-43
• 4.1.1 菌株与质粒41
• 4.1.2 培养基与培养条件41-42
• 4.1.3 工具酶与试剂42
• 4.1.4 实验动物42
• 4.1.5 主要仪器与设备42
• 4.1.6 主要溶液的配制42-43
• 4.1.7 PCR 引物43
• 4.2 实验方法43-49
• 4.2.1 低过敏原性 mAra h 2.02 基因的制备43-45
• 4.2.2 乳酸乳球菌表达载体 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的构建45-46
• 4.2.3 重组蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达及 Western blot 检测分析46-47
• 4.2.4 花生粗蛋白(CPE)的提取及鉴定47
• 4.2.5 灌胃用重组菌的制备47-48
• 4.2.6 动物实验48
• 4.2.7 花生过敏反应各项指标的检测48-49
• 4.2.8 数据处理49
• 4.3 结果与讨论49-58
• 4.3.1 低过敏原性 mAra h 2.02 基因的获得49-51
• 4.3.2 乳酸乳球菌表达载体 pNZ-nh2 及 pNZ-mh2 的构建51-52
• 4.3.3 重组菌 L. lactis NZNH 和 L. lactis NZMH 中表达蛋白的鉴定52-53
• 4.3.4 花生过敏症状的评分53-54
• 4.3.5 重组乳酸菌对小鼠血清总 IgE 抗体的影响54-55
• 4.3.6 小鼠血清中特异性抗体的检测55-56
• 4.3.7 小鼠血清中 MCP-1 含量和粪便中组胺含量的检测56-57
• 4.3.8 重组乳酸菌对小鼠粪便中总 IgA 抗体的影响57
• 4.3.9 体外细胞因子的检测57-58
• 4.4 本章小结58-60
• 主要结论60-61
• 存在的问题与展望61-62
• 致谢62-63
• 参考文献63-69
• 附录69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王斌;但国蓉;袁静;魏泓;;乳杆菌黏附抑制致病性大肠杆菌对肠上皮样细胞侵袭的初步研究[J];解放军医学杂志;2006年06期

本文编号：677115