miR-1对软骨细胞增殖分化的影响
发布时间：2017-08-16 20:16
本文关键词：miR-1对软骨细胞增殖分化的影响
【摘要】：研究背景 骺板软骨内源性成骨过程决定肢体的长度，一旦受损会影响肢体的正常发育。据统计16岁以下儿童长骨损伤累及骺板的约占15%-30%，其中1%-2%的骺板损伤会引起骺板早闭，导致肢体生长障碍及畸形，难以治疗。目前研究认为，内源性成骨实际上是一个复杂的细胞增殖与分化的过程，而这些变化都是以细胞基因精确表达的形式实现的。最近研究，这些基因的表达受控于microRNAs（miRNAs）。有研究发现，miR-1在心肌、骨骼肌中特异性高表达，能促进其正常发育。有研究发现miR-1在骺板软骨中特异性高表达，那么miR-1是否能调控软骨细胞的增殖和分化，目前还不清楚。故本实验选择分离鸡胚胸骨增殖区软骨细胞，分别通过用外源性的miR-1及其抑制剂进行转染，使miR-1过表达和相应沉默来观察其对软骨细胞增殖和分化的影响。 方法 （1）取16日龄的鸡胚，取其胸骨并分离增殖区软骨细胞，进行原代培养并按120nM进行miR-1/antimiR-1及其对照剂的细胞转染。（2）通过Elisa技术检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、MMP-13及TIMP-1在蛋白水平上变化，观察过表达/沉默miR-1对软骨细胞表型维持的影响。（3）利用CCK-8法检测转染后，不同时间点miR-1对软骨细胞增殖能力的影响；同时对软骨细胞增殖明显的时间点利用流式细胞技术对其进一步验证。（4）通过Realtime-PCR技术检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox9、Ihh以及MMP-13等指标的变化，，在基因水平上观察过表达/沉默miR-1对软骨细胞表型维持、增殖和分化的影响。 结果 分离培养鸡胚胸骨增殖区软骨细胞，以1×105/ml的密度接种在6孔板中在37℃恒温箱中培养，待细胞达70%的融合后进行miR-1/antimiR-1及其对照剂的转染。（1）软骨细胞增殖：①软骨细胞表型维持：Realtime-PCR检测：miR-1过表达Ⅱ型胶原和Sox9等指标在基因水平上表达量增加；而MMP-13在基因水平上表达下降（P㩳0.05）。抑制miR-1后，Ⅱ型胶原和Sox9等指标在基因水平上表达量下降；而MMP-13在基因水平上表达增加（P㩳0.05）。Elisa证明：miR-1过表达蛋白多糖、Ⅱ型胶原及TIMP-1在蛋白水平表达增高；MMP-13在蛋白水平表达降低（P㩳0.05）。而抑制miR-1后，蛋白多糖、Ⅱ型胶原及TIMP-1在蛋白水平表达降低；MMP-13在蛋白水平表达增高（P㩳0.05）。②软骨细胞增殖：CCK-8技术显示：miR-1过表达能促进软骨细胞的增殖（P㩳0.05），而抑制miR-1后，软骨细胞的增殖能力下降（P㩳0.05）。流式细胞技术验证：miR-1过表达使处于S期、G2期的细胞明显增加，而抑制miR-1后，处于S期、G2期的细胞显著下降（P㩳0.05）。（2）软骨细胞分化：Realtime-PCR检测：miR-1过表达：Ⅱ型胶原、Sox9和Ihh的基因表达显著上调；而Ⅹ型胶原的表达显著下降（P㩳0.05）。而抑制miR-1后，Ⅱ型胶原、Sox9和Ihh的基因表达显著下降；而Ⅹ型胶原的表达显著增加（P㩳0.05）。Elisa检测：miR-1过表达,Ⅱ型胶原在蛋白水平表达显著上调（P㩳0.05）；而抑制miR-1后，Ⅱ型胶原在蛋白水平表达显著上调（P㩳0.05）。 结论 miR-1能促进软骨细胞增殖，抑制其分化；同时在维持软骨细胞表型方面有一定作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 英文缩略词表5-6
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-11
- 前言11-13
- 材料与方法13-19
- 结果19-30
- 讨论30-32
- 结论32-33
- 参考文献33-35
- 综述35-47
- 参考文献42-47
- 个人简历47-48
- 致谢48
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 詹新立,周江南;骺板损伤的诊断与治疗的新进展[J];临床小儿外科杂志;2003年02期
2 田攀;董世武;;microRNA在骨发育和形成过程中作用的研究进展[J];中国骨质疏松杂志;2010年01期
3 姚运峰;康鹏德;裴福兴;;骨骺骺板的生长发育及其影响因素[J];中国矫形外科杂志;2010年17期
本文编号：685304
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