人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因编码蛋白抗体制备及其免疫原性研究

发布时间：2017-08-19 02:34

  本文关键词：人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因编码蛋白抗体制备及其免疫原性研究

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【摘要】：目的: 制备人巨细胞病毒（HCMV）临床病毒株UL148基因的抗体并对其进行免疫原性分析。 方法： 1.应用生物信息学方法，以HCMV临床病毒株D2UL148基因氨基酸序列为基础，采用SOPMA、GOR、HNN方法预测二级结构，结合跨膜结构、HoppWoods亲水性方案、Zimmerman极性方案、Emini可及性方案、Jameson-Wolf抗原性方案及柔韧性参数综合预测UL148基因B细胞表位。 2.化学合成法合成3条HCMV UL148基因分值较高的抗原多肽，，并予免疫新西兰大白兔（经初次免疫及加强免疫后）获取免疫兔血清，饱和硫酸铵沉淀法纯化兔血清中相应多肽抗体，并用间接Elisa法鉴定3条多肽在不同免疫时间的抗体效价及免疫原性。 3.将HCMV病毒接种于生长状态良好的人包皮成纤维细胞（HFF），提取病毒感染后的细胞总蛋白，采用Western Blot免疫沉淀法鉴定HCMV UL148基因相应抗体反应的特异性及敏感性。 结果： 1.综合多种预测方法，HCMV UL148基因265-275、221-229、18-25位氨基酸序列区域内或其附近主要以无规则卷或β-转角结构为主，且抗原指数较高，确定P1(HCMV UL148265-275)、P2（HCMV UL14818-25）、P3（HCMV UL148221-229）为HCMV UL148基因候选B细胞表位。 2.合成的3条多肽于1w、3w、5w不同时间段免疫新西兰大白兔，经初次免疫（1w）及加强免疫（3w、5w）后可明显诱导新西兰大白兔免疫血清抗体滴度增高；经间接Elisa法检测可得3条多肽均能刺激机体产生抗体，抗体效价随着免疫次数增加而升高，最高达1：12800以上。 3.经Western Blot免疫沉淀法鉴定，感染HCMV后的人包皮成纤维细胞能与P3多肽（HCMV UL148221-229）诱导的新西兰大白兔的抗体呈阳性反应，与P1、P2呈阴性反应。 结论： 1.应用生物信息学技术，成功筛选了具有重复性好、抗原指数高的3条HCMV UL148基因候选B细胞表位。 2.化学合成的3条多肽，均能免疫新西兰大白兔产生抗体，随着免疫加强，其抗体水平相应增高。 3. P3（HCMV UL148221-229）抗体能与临床病毒株HCMV UL148基因发生特异性结合，该抗体为研究HCMV临床病毒株UL148蛋白的功能及其免疫学特性奠定重要基础。
【关键词】：人巨细胞病毒 UL148 B细胞表位 多肽免疫
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 目录2-4
• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略词表9-10
• 第一章 前言10-17
• 1. HCMV 概述10-11
• 2. HCMV 研究现况11-14
• 3. HCMV UL148 基因研究现状14-15
• 4. B 细胞抗原表位研究现状15-16
• 5. 本课题研究的意义16-17
• 第二章 技术路线17-18
• 第三章 仪器及材料18-21
• 1. 主要仪器18-19
• 2. 实验材料19-21
• 2.1 主要试剂19-20
• 2.2 菌种和病毒株20
• 2.3 其他主要试剂配方20-21
• 第四章 研究内容21-35
• 1．HCMV UL148 基因 B 细胞抗原表位预测及分析21-22
• 1.1 实验材料21
• 1.2 HCMV UL148 基因 B 细胞表位预测方案21
• 1.3 HCMV UL148 基因 B 细胞表位合成21-22
• 2．HCMV UL148 基因的抗体制备22-23
• 2.1 实验材料22
• 2.2 免疫动物及血清抗体制备22-23
• 3．酶联免疫法（ELISA）测定抗体血清效价23-24
• 3.1 ELISA 法测定第 1w、3w、5w 兔血清抗体效价23-24
• 3.2 ELISA 法测定第 5w 兔产生血清抗体工作浓度24
• 4．HCMV UL148 基因抗体鉴定24-35
• 4.1 HFF 细胞培养24-25
• 4.2 HCMV 病毒培养及鉴定25-31
• 4.3 HCMV 感染细胞后总蛋白提取31-32
• 4.4 Western Blot 鉴定 HCMV UL148 基因抗体32-35
• 第五章 结果与分析35-46
• 1．HCMV UL148 基因 B 细胞抗原表位预测及分析35-39
• 1.1 HCMV UL148 基因氨基酸序列35
• 1.2 HCMV UL148 基因 B 细胞表位多种方案预测结果35-38
• 1.3 P1、P2、P3 多肽合成结果38-39
• 2．酶联免疫法（ELISA）对抗血清效价的测定结果39-41
• 2.1 ELISA 测定第 1w、3w、5w 兔产生血清抗体效价结果39-40
• 2.2 ELISA 测定第 5w 兔产生血清抗体工作浓度结果40-41
• 3．HCMV UL148 基因抗体鉴定41-46
• 3.1 HFF 细胞的培养41-42
• 3.2 HCMV 病毒培养及鉴定结果42-44
• 3.3 全蛋白提取物蛋白定量（BCA 法）44-45
• 3.4 Western Blot 鉴定 HCMV UL148 基因抗体结果45-46
• 第六章 讨论46-49
• 1．B 细胞抗原表位的选择46-47
• 2．多克隆抗体制备47-48
• 3．HCMV 的感染及鉴定48-49
• 第七章 结论和展望49-50
• 1．结论49
• 2．研究展望49-50
• 参考文献50-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郭媛媛;王波;胡兢晶;苏海浩;丁俊彩;谢斌华;伍苑宾;;人巨细胞病毒临床分离株的鉴定及UL148基因分析[J];中国妇幼保健;2012年22期

本文编号：698219