猪螺杆菌聚合酶链反应检测方法的建立及初步应用

发布时间：2017-08-23 08:06

  本文关键词：猪螺杆菌聚合酶链反应检测方法的建立及初步应用

  更多相关文章： 猪螺杆菌 实时荧光定量-聚合酶链反应 幽门螺杆菌 蛋白表达 支原体

【摘要】：本课题研究除包括“猪螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用”外,还根据课题组的安排,进行了“幽门螺杆菌重要蛋白的原核表达和纯化”和“艾滋病相关支原体多重实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立”两项研究,主要内容如下： 第一部分：猪螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用 猪螺杆菌(Helicobacter suis,简称H.suis)是一种微需氧的革兰氏阴性菌,是最常见的非幽门螺杆菌的螺杆菌(NHPH).它存在于60%的屠宰猪胃中,与猪慢性胃炎和溃疡相关。人类可能通过与感染的动物接触或污染的食物而感染H.suis, H.suis也与人类的慢性胃炎和溃疡疾病相关。 本研究选取来自中国3个地区的420份快速尿素酶检测阳性胃黏膜标本(来自重庆市第三军医大学附属大坪医院、安徽医科大学第一附属医院、北京军区总医院和北京大学第三医院),采用基于H.suis尿素酶基因特异引物的聚合酶链反应(PCR)检测方法,对它们的H.suis感染状况进行了实验室检测和分析。利用H.suis尿素酶基因特异引物从标本核酸中扩增出相应的目的片段,与已知序列比对结果同源性接近100%,说明人群中存在H.suis的感染。结果共检测到26份阳性标本,H.suis的阳性检测率达6.2%,且感染率可能存在地域和人群差异(0-7.7%),首次提供了我国内镜受检人群尿素酶检测阳性胃黏膜标本的H.suis阳性率,为进一步H.suis的分离培养及相关疾病的防治提供了重要信息。 实验中,使用Beacon Designer7.0软件在H.suis gryB和ure B基因保守区域设计引物及荧光探针,建立并优化实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time)检测体系,并对体系的特异度和灵敏度进行评价。建立了一种快速、准确的H.suis real-time PCR检测方法,其检测灵敏度比普通PCR高且耗时较短,为以后开展相关检测和分析奠定基础。 第二部分：幽门螺杆菌重要蛋白的原核表达和纯化 幽门螺杆菌Helicobacter pylori,简称H.pylori)也是一种微需氧的革兰氏阴性菌,为慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌,并与胃癌和胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关,被列为I类致癌因子。目前,H. pylori感染导致胃癌的致病机制仍不明确。 本研究选取与H. pylori感染导致胃癌发生密切相关的3种蛋白,通过蛋白生物信息学如信号肽、二级结构等系列分析、引物设计、聚合酶链反应(PCR)扩增、连接构建pET28a(+)表达载体后,通过转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达并进行纯化,获得大量预期大小的表达蛋白,该蛋白经质谱鉴定与实验设计目标蛋白氨基酸序列100%同源。本研究成功构建了3种幽门螺杆菌的重组原核表达质粒,且研究中获得的纯化蛋白可以为进一步的蛋白功能研究及H.pylori致病机制研究提供一定的前期基础。 第三部分：艾滋病相关支原体多重实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立 穿透支原体(Mycoplasma penetrans, Mpe)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans, Mf)和梨支原体(Mycoplasma pirum, Mpi)是近年来新发现的艾滋病相关支原体,国外研究表明,这3种支原体是艾滋病感染的协同因子和发病的诱发因素。本研究的目的是建立一种快速、灵敏和特异的艾滋病相关支原体多重实时荧光聚合酶链反应(Multiplex real-time PCR)检测技术。使用Beacon Desigener7.0软件在穿透支原体和发酵支原体的ftsZ基因以及梨支原体的rpoB基因保守区域设计多重引物和荧光探针,建立并优化艾滋病相关支原体Multiplex real-time PCR检测体系。分别使用3种支原体阳性质粒标准品评价体系的灵敏度,使用8种其他支原体、14种常见致病菌和人类基因组核酸评价该体系的特异度,并与普通聚合酶链反应(PCR)检测方法进行比较。该Multiplex real-time PCR方法对穿透支原体和发酵支原体检测灵敏度为103拷贝,约为普通PCR的10倍,对梨支原体检测灵敏度为102拷贝,约为普通PCR的100倍。该体系对8种其他支原体、14种常见致病菌和人类基因组均不能扩增。本研究建立的Multiplex real-time PCR方法可同时快速、准确地检测穿透支原体、发酵支原体和梨支原体。有望用于临床标本检测,完善对艾滋病相关支原体的检测能力。
【关键词】：猪螺杆菌 实时荧光定量-聚合酶链反应 幽门螺杆菌 蛋白表达 支原体
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 主要英文缩略语索引5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一部分 猪螺杆菌PCR检测方法的建立及初步应用11-32
• 前言11-14
• 材料与方法14-21
• 一、材料14-16
• 二、方法16-21
• 结果21-30
• 讨论30-31
• 小结31-32
• 第二部分 幽门螺杆菌重要蛋白的原核表达和纯化32-56
• 前言32-33
• 材料与方法33-47
• 一、材料33-40
• 二、方法40-47
• 结果47-54
• 讨论54-55
• 小结55-56
• 第三部分 艾滋病相关支原体多重实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立56-63
• 前言56-57
• 材料与方法57-59
• 结果59-62
• 讨论62-63
• 参考文献63-70
• 综述70-75
• 参考文献72-75
• 发表论文75-76
• 致谢76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李岩;幽门螺杆菌检测方法[J];中国实用内科杂志;2002年01期

2 于新芬;潘劲草;孟冬梅;汪皓秋;张蔚;郑伟;;多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻性大肠埃希菌[J];中华预防医学杂志;2007年06期

3 糜祖煌,赵季文,秦玲;淋病患者AIDS相关支原体的分离培养与核酸检测[J];中国人兽共患病杂志;2003年03期

4 贾成梅,赵季文,糜祖煌,施素洁,羊海涛;从艾滋病患者和HIV感染者中分离2株支原体[J];中国人兽共患病杂志;2003年06期

5 肖迪;赵飞;宋衍燕;孟凡亮;何利华;王海滨;张慧芳;张建中;;幽门螺杆菌CagA对AGS细胞RNA转录相关磷酸化蛋白的影响[J];胃肠病学和肝病学杂志;2009年04期

，

本文编号：723896